人工老化對沙蔥種子中活性氧與超微弱發光的影響

(內蒙古農業大學園藝與植保學院，內蒙古野生特有蔬菜種質資源與種質創新重點實驗室， 呼和浩特 010019)

種子老化(Seed aging)是指種子生存能力下降，使得種子喪失活力及萌發力的不可逆轉變化，是在種子成熟后發生和發展的、自然而不可避免的過程，其起因與有害物質積累、內源激素紊亂、生物大分子變性和膜系統損傷等有關。目前，關于種子老化的具體機制尚不清楚，一般認為老化過程會表現出種子活力降低，膜脂過氧化，保護酶、蛋白質和核酸降解等特點[1]。因此，探究種子老化機理及如何緩解種子老化意義重大。研究發現，種子在生產中肥料供給充足，種子貯藏時降低種子含水量，低溫、低濕貯藏等方法可以有效緩解種子老化[2]。沙蔥種子貯藏過程中易發生老化劣變，在老化過程中活性氧和超微弱發光如何響應，是否可通過超微弱發光的強弱來無損傷的鑒定種子活力以及如何緩解種子的老化等問題未見報道。因此，本試驗通過鈰離子+人工老化處理沙蔥種子，研究鈰離子對沙蔥老化種子的活性氧與超微弱發光的影響，以期為沙蔥種質資源的保存提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試 材

以2016年采自鄂爾多斯市鄂托克前旗荒漠草甸的沙蔥(AlliummongolicumRegel.)種子為試材,千粒重為(2.28±0.06)g,初始含水量為(5.78±0.33)%。

1.2 浸種處理

選擇飽滿、大小一致、無破損的沙蔥種子，經400 mg·L-1Ce3+(氯化亞鈰)浸種6 h后鋪在濾紙上室溫晾干。

1.3 人工老化處理

采用高溫高濕法對沙蔥種子進行人工老化[3]，設定老化箱溫度50 ℃，相對濕度(RH)為100%。老化處理時間分別為0，5，15，25 h和35 h。經Ce3+浸種后再人工老化處理分別記為Ce3+0、Ce3+1、Ce3+2、Ce3+3、Ce3+4；未經Ce3+浸種直接老化的沙蔥種子分別記為ck0、ck1、ck2、ck3、ck4；老化完畢后取出種子，在室溫下晾干至其原始水分，然后密封保存在4 ℃冰箱中備用。

1.4 萌發指標測定

取處理好的沙蔥種子，用1%的次氯酸鈉溶液殺菌消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈后放在鋪有2層濾紙的培養皿(d=9 cm)中進行萌發試驗，恒溫培養箱溫度為(20±1)℃，每皿50粒種子，4次重復。每隔24 h記錄發芽數并補水，第10天結束試驗，統計發芽率和發芽勢，測定鮮重以及胚根長，計算發芽指數和活力指數。

發芽勢(%)=(第3天發芽種子數/測定種子總數)×100%[4]；

發芽率(%)=(發芽種子數/測定種子總數)×100%[4]；

發芽指數=∑Gt/Dt，Gt為t時間內的發芽數，Dt為相應的發芽日數[4]；

活力指數=發芽指數×鮮重。

1.5 生理指標測定

超微弱發光的測定使用超微弱發光測試系統(BPCL-2-SH)，共測5次，減去本底取平均值，即為沙蔥種子的最終發光強度。

1.6 數據分析

用 Microsoft Excel 2007 軟件作圖，差異顯著性用Duncan’s檢驗，SPSS 17.0 軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 人工老化對沙蔥種子萌發及活力的影響

由表1可知，沙蔥種子各萌發指標隨著老化時間的延長呈降低的趨勢。ck0的各發芽指標顯著高于ck1、ck2、ck3、ck4，在老化35 h后，活力指數為1%，表明沙蔥種子幾乎失活。而Ce3+處理下，Ce3+1各發芽指標值高于ck1，平均發芽率比ck1高4%，活力指數比ck1高0.042，平均胚根長比ck1長1.64 cm。表明Ce3+有助于提高老化初期沙蔥種子活力及促進胚根的伸長。

2.2 人工老化對沙蔥種子相對電導率的影響

由圖1可知，沙蔥種子相對電導率隨著老化時間的延長呈先增大后減小再增大的趨勢，但各處理間差異不顯著，其中ck1相對電導率高于其他處理，表明種子隨老化脅迫種子結構發生改變，內部物質外滲。而Ce3+處理，電導率隨著老化時間的延長呈先減小再增大的趨勢；在老化處理5 h之前，Ce3+處理后的電導率值低于ck，隨后老化脅迫作用大于Ce3+處理作用，種子相對電導率隨對照逐漸升高。表明在老化程度較低的情況下，Ce3+前處理對沙蔥種子電解質外滲有一定緩解作用。

處理發芽勢/%發芽率/%發芽指數活力指數鮮重/g胚根長/cmck048+1.2a87+0.5a0.987+0.52a0.760+0.02a0.770+0.08a10.93+1.39ack115+3.2b58+1.0b0.547+0.28b0.205+0.05b0.375+0.01b9.03+0.58abck20c29+0.5c0.157+0.07c0.043+0.01c0.275+0.02c7.80+0.79bcck30c18+1.0d0.080+0.04d0.017+0.01d0.215+0.02cd6.87+1.27cck40c3+0.5e0.004+0.01e0.010+0.01e0.185+0.01d3.23+0.32dCe3+037+1.1a90+1.0a0.963+0.50a0.862+0.02a0.895+0.11a10.13+0.96aCe3+111+2.4b62+1.0b0.536+0.27b0.247+0.06b0.460+0.01b10.67+1.01aCe3+20c29+1.5c0.169+0.08c0.046+0.01c0.270+0.01c7.60+1.15bCe3+30c14+1.1d0.060+0.03d0.016+0.01d0.265+0.01c5.80+0.44cCe3+40c6+0.3e0.023+0.01e0.005+0.01e0.230±0.01c3.80+0.52d

圖1 人工老化過程中沙蔥種子相對電導率變化

2.3 人工老化對沙蔥種子呼吸速率的影響

由圖2可知，沙蔥種子呼吸速率隨著老化時間的延長呈先增大后減小的趨勢，ck1呼吸速率最大，為0.12μmol·(g·min)-1，顯著高于其他處理。Ce3+處理組與ck有相似趨勢，Ce3+1處理呼吸速率最大。在老化15 h之前，Ce3+處理結果低于ck，在老化處理15 h之后，Ce3+處理結果又高于ck。在老化5 h到15 h時，呼吸速率降低的最快，表明在此階段物質消耗最多。

圖2 人工老化過程中沙蔥種子呼吸速率變化

2.4 人工老化對沙蔥種子活性氧的影響

圖3 人工老化過程中沙蔥種子超氧陰離子產生速率的變化

圖4 人工老化過程中沙蔥種子過氧化氫含量的變化

2.5 人工老化對沙蔥種子超微弱發光的影響

由圖5可知，沙蔥種子超微弱發光強度隨老化時間的延長呈逐漸降低的趨勢，各處理間差異顯著，ck2、ck3和ck4比ck0分別降低了30%、37.3%和73.3%。

表2 沙蔥種子活力與部分生理指標間的相關性

處理GPGRGIVIFWRLECRRO·-2H2O2UWLGP10.926*0.971**0.997**0.990**0.7670.6380.6660.4940.2830.726GR0.924*10.987**0.916*0.943*0.931*0.6670.885*0.7850.5810.923*GI0.968**0.990**10.959**0.971**0.8660.7060.8240.6830.4660.853VI0.999**0.923*0.965**10.995**0.7670.5760.6330.4730.2570.714FW0.998**0.940*0.977**0.998**10.8210.5560.6820.5460.3210.769RL0.6860.910*0.8430.6860.72210.4600.882*0.879*0.7730.986**EC-0.167-0.467-0.375-0.142-0.203-0.72410.7340.5140.4130.554RR0.7500.937*0.885*0.7460.7830.989**-0.72110.955*0.8100.943*O·-20.4490.6860.5990.4610.5020.868-0.6630.85210.8760.934*H2O20.4210.6880.5930.4310.4740.895*-0.7250.8700.993**10.837UWL0.6220.8490.7730.6300.6670.970**-0.6800.956*0.959**0.967**1

注：GP為發芽勢；GR為發芽率； GI為發芽指數；VI為活力指數；FW為鮮重；RL為胚根長；EC為電導率；RR為呼吸速率。*表示在0.05水平顯著相關；**表示在0.01水平極顯著相關。

在Ce3+處理組中，Ce3+比ck的超微弱發光強度高，Ce3+1和Ce3+0的超微弱發光強度差異不顯著，Ce3+0顯著高于Ce3+2、Ce3+3和Ce3+4的超微弱發光強度，Ce3+2、Ce3+3和Ce3+4比Ce3+0分別降低了18.4%、32%和68%。

圖5 人工老化過程中沙蔥種子超微弱發光的變化

2.6 相關性分析

3 討 論

3.1 人工老化對沙蔥種子活性氧的影響

3.2 人工老化對沙蔥種子超微弱發光的影響

超微弱發光( Ultraweak luminescence，UWL)檢測技術可以在不破壞生物體時探究生物體生理信息，研究發現超微弱發光與生物機體的氧化代謝、細胞分裂和死亡、細胞內和細胞間的信息傳遞以及生長過程等有著密切的聯系[19-20]。研究發現，小麥種子隨著老化程度的加深，超微弱發光強度逐漸降低[21-22]。在ck處理組，超微弱發光與發芽率呈顯著正相關。這與張文蘭等[23]的研究結果一致。而龐靖祥等研究發現，板藍根種子的發芽率與其自發發光的強度是負相關的[24]。本試驗中發現，在ck 處理組，超微弱發光強度與相對電導率呈正相關，在Ce3+處理組，兩者呈負相關。這與田茜等[25]的研究結果一致，表明Ce3+有效作用細胞的生物膜系統，有效的緩解了細胞膜的破壞和種子內含物外滲。

圖6 蘋果酸調控植物程序性細胞死亡模式圖

綜上所述，在種子的加速老化過程中，超微弱發光強度與活性氧、呼吸作用、發芽指標等生理指標有一定相關性，Ce3+處理可調控活性氧的增加，減緩老化對細胞損傷，維持各項功能穩定性。超微弱發光強度與活性氧呈極顯著相關，表明超微弱發光強度隨活性氧的變化而變化，與生物化學提出的“活性氧”機制相一致。然而，Ce3+是如何調控活性氧迸發，緩解沙蔥種子老化，以及在生物變化的某個過程或影響生物某個代謝循環需要進行深入的分析；另外，本試驗發現在老化5 h是Ce3+處理和ck在相對電導率高低的分界點，細胞受脅迫的程度可通過測定細胞電解質滲出率反應, 電導率數值的大小反應細胞膜透性的變化, 兩者的變化趨勢一[26]，因此將在接下來的細胞膜透性試驗中驗證。相關系數分析得出超微弱發光與超氧陰離子產生速率和過氧化氫含量呈極顯著正相關，研究發現線粒體組分參與PCD表明線粒體也能觸發和執行PCD過程，ROS可以充當誘導PCD的信號分子，改變線粒體膜通透性，細胞色素C和線粒體電子傳遞鏈(mETC)崩解釋放的ROS足以促使PCD的發生達到致死水平[27]?？杉傧敕N子老化過程ROS的產生可誘導種子PCD(圖6),又UWL相關ROS，推測在細胞外UWL反映PCD形態特征，在細胞內ROS反映PCD生理特征。在擬南芥中, 葉綠體中生成的蘋果酸通過DiT 1運輸至細胞質，繼而被某個/某些轉運蛋白轉運至線粒體。蘋果酸在線粒體中被mMDH 1催化形成草酰乙酸，并伴隨著NADH的積累，為線粒體膜上的mETC復合體提供電子，產生ROS，進而導致產生程序性細胞死亡[28]。