沉默BCRP表達抑制乳腺癌細胞對阿霉素耐藥的機制研究

馬海琳,車少敏,王曉麗,張曉智

(西安交通大學第一附屬醫院腫瘤放射治療科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:mhl7906@163.com)

乳腺癌(breast cancer,BC)發病率為全球惡性腫瘤第2位,是導致癌癥死亡的第5大主要原因;2018年全球癌癥數據顯示,在女性惡性腫瘤中,乳腺癌發病率、死亡率均居首位[1]。我國是乳腺癌高發國家,2018年國家癌癥中心發布數據顯示,在女性惡性腫瘤中,乳腺癌發病居首位,城市高于農村,并呈現逐年增加趨勢[2]。目前,乳腺癌的治療以手術、放療、化療、內分泌治療靶向治療及免疫治療[3]等手段為主?；熢谌橄侔┚C合治療中的作用尤為重要,特別是晚期乳腺癌和三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC);但多藥耐藥(multi-drug resistance, MDR)常導致化療抗拒,致乳腺癌復發和轉移,限制了乳腺癌有效治療。研究表明MDR是一個極其復雜且不斷變化的過程,是多基因、多因子共同參與,并通過多途徑來完成的?？朔﨧DR的方法包括使用逆轉劑、基因調控技術等。

乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)是分子量為72 kD的跨膜蛋白,其基因定位于4q22.23,全長66 kb,編碼基因為ABCG2[4]。BCRP屬ATP結合盒(ABC)膜轉運蛋白超家族,其耐藥機制與P-gp相似,通過水解ATP供能將抗腫瘤藥物逆濃度梯度由細胞內轉運出胞外,從而使胞內藥物濃度降低;研究發現,BCRP特異性使乳腺癌細胞對多種抗腫瘤藥物抵抗,如阿霉素、米托蒽醌、拓撲替康等[5,6]。本研究探索沉默BCRP基因能夠提高乳腺癌MCF-7/ADR細胞對阿霉素的藥物敏感性及其分子機制,針對BCRP基因合成BCRP siRNA,轉染乳腺癌細胞,分別用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測乳腺癌細胞BCRP mRNA及蛋白表達變化,MTT法檢測細胞增殖,流式細胞術檢測細胞凋亡,觀察RNA干擾BCRP基因對乳腺癌細胞多藥耐藥的影響;并用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測p53、Bcl-2及PKC表達來研究多藥耐藥分子機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

乳腺癌MCF-7/ADR細胞由西安交通大學醫學部教育部環境與基因相關疾病重點實驗室提供。SYBRR Premix Ex TaqTMkit,TaKaRa Ex Taq HS(TaKaRa,中國),RPMI1640培養基和胎牛血清(GIBCO,USA),Annexin Ⅴ-PI凋亡試劑盒(BD Bioscience,USA),ECL化學發光底物試劑盒(Pierce,USA),TRIzol Reagent(Invitrogen,USA);HRP標記抗小鼠IgG(KPL,USA);兔單克隆anti-BCRP,兔單克隆anti-β-Actin(Santa Cruz,CA,USA);兔單克隆anti-p53,兔單克隆anti-Bcl-2,兔單克隆anti-PKC(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)。

1.2 主要儀器

二氧化碳培養箱Galaxy S(英國RS Biotech),FASCalibar流式細胞儀(FALS CALIBAR BD),高通量多功能微板測試系統(德國MG Labtechnologies),倒置相差顯微鏡(OLYMPUS,Japan),PCR儀(PTC-100)(MJ Research,USA),iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System(BioRad,USA),濕法蛋白電轉印系統DYCZ-40D(北京六一儀器廠)。

1.3 細胞培養

常規復蘇液氮凍存的乳腺癌MCF-7/ADR細胞,用含10%胎牛血清及雙抗(鏈霉素、青霉素)的RPMI1640培養基,在37 ℃、5% CO2培養,在細胞密度為80%、處于對數生長期時傳代;2 d更換培養液1次,每日觀察細胞生長情況變化;細胞處于對數生長期、細胞狀態良好時進行實驗。

1.4 siRNA的設計、合成及轉染

siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成,序列見表1。轉染前將Lipofectamine2000與相應劑量的基礎培養液混合,室溫孵育5 min;將siRNA與相應劑量的基礎培養液混合,室溫孵育5 min;再將前兩者混合,室溫孵育15 min,將siRNA-Lipofectamine2000混合物加入培養板轉染,繼續培養至收獲時間。

表1 BCRP siRNA序列

Table 1 The sequences of BCRP siRNA

1.5 MTT比色法分析實驗

實驗分正常對照組、陰性對照組(negative siRNA)、siRNA(50 nmol/L)組。轉染siRNA后,再給各組加入阿霉素,濃度為25,50,100,200,400,800 ng/ml,空白孔加入完全培養基,加入藥物后繼續培養48 h。培養細胞在收獲前4 h,每孔加入20 μl 5 mg/ml MTT溶液,于孵箱中培養至收獲時間。每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液,繼續孵箱中培養4 h;取出、棄上清,加入150 μl DMSO,震蕩15 min,促使結紫色晶充分溶解。在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值,檢測波長為490 nm,以只加培養液孔為空白對照組。各平行孔取均值后以下式計算細胞相對存活率。細胞相對存活率(%)=(OD實驗組/OD對照組)×100%(以空白組OD值為零)。各組實驗均重復3次。

1.6 細胞凋亡檢測

細胞處理后培養、制備成濃度為1×105個/ml的懸浮細胞,向5 ml流式管中加入100 μl的細胞懸液,再向每管加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml的碘化丙錠,混勻后避光反應15 min;向避光反應完畢的樣品中加入400 μl PBS。將處理完畢的樣品,用FASCalibar流式細胞儀檢測。

1.7 實時熒光定量PCR分析PKC、P53、Bcl-2 mRNA的相對水平

實驗分為:對照組、陰性對照組、siRNA(50 nmol/L)組、阿霉素組(200 ng/ml)、siRNA+阿霉素組。各引物由TaKaRa公司設計與合成(見表2)。各實驗組與細胞對照組之間目的基因擴增變化,通過根據公式Folds=2-ΔΔCt計算各檢測目的基因的相對表達量。其中ΔΔCt=(Ct檢測基因-Ctβ-actin)實驗組-(Ct檢測基因-Ctβ-actin)對照組。

表2 實時熒光定量PCR引物

Table 2 Primer sequences used for real-time quantitative PCR

1.8 免疫蛋白印跡分析PKC、P53、Bcl-2蛋白表達

細胞轉染48 h時,RIPA裂解液裂解細胞,SDS-PAGE電泳完畢后,將蛋白轉膜至PVDF膜,放入封閉緩沖液中室溫封閉1 h,Rabbit monoclonal anti-BCRP(1 ∶2 000)、Rabbit monoclonal anti-p53(1 ∶1 000)、Rabbit monoclonal anti-PKC(1 ∶2 000)、Rabbit monoclonal anti-Bcl-2(1 ∶2 000)、Rabbit monoclonal anti-β-Actin(1 ∶5 000)一抗4 ℃孵育過夜，棄一抗、TBST 輕搖洗膜3次,加入HRP標記抗小鼠IgG二抗(1 ∶5 000),室溫孵育2 h,棄二抗、TBST輕搖洗膜3次,ECL發光顯色檢測目的蛋白,實驗以β-actin為內參。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 轉染BCRP siRNA后MCF-7/ADR細胞中BCRP mRNA表達下調

實時定量PCR結果顯示,與陰性對照組比較,轉染BCRP siRNA實驗組BCRP mRNA表達量顯著降低至(30.5±9.2)%(P<0.01,見圖1)。Western blot實驗結果顯示,轉染BCRP siRNA后,其蛋白表達量明顯下調(見圖2)。

2.2 轉染BCRP siRNA對MCF-7/ADR細胞增殖的影響

MTT實驗結果顯示,與陰性對照組比較,處理48 h和72 h時BCRP siRNA組、阿霉素組、BCRP siRNA+阿霉素組MCF-7/ADR細胞的增殖能力均顯著降低;與阿霉素組比較,BCRP siRNA+阿霉素組MCF-7/ADR細胞的增殖能力顯著降低(P<0.01,見圖3)。

與陰性對照組比較,*P<0.01圖1 轉染BCRP siRNA后乳腺癌MCF-7/ADR細胞中BCRP mRNA表達變化Figure 1 The changes of BCRP mRNA expression after transfection with BCRP siRNA in MCF-7/ADR cells

1.空白對照;2.陰性對照;3.BCRP siRNA圖2 轉染BCRP siRNA后乳腺癌MCF-7/ADR細胞中BCRP蛋白表達變化Figure 2 The changes of BCRP expression after transfected with BCRP siRNA in MCF-7/ADR cells

同時點與陰性對照組比較,*P<0.01;同時點與阿霉素組比較,#P<0.01圖3 轉染BCRP siRNA對MCF-7/ADR細胞增殖的影響 (MTT比色分析)Figure 3 Effect of BCRP siRNA on MCF-7/ADR cell proliferation by MTT assay

2.3 轉染BCRP siRNA對MCF-7/ADR細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測細胞凋亡實驗結果顯示,陰性對照組早期凋亡細胞為(6.16±0.5)%;晚期凋亡細胞為(2.32±0.39)%。與陰性對照組相比,BCRP siRNA+阿霉素組早期凋亡細胞顯著增加,為(28.67±5.28)%(P<0.01);晚期凋亡細胞也增加,為(20.39±3.49)%(P<0.01,見圖4,5)。

與陰性對照組比較,*P<0.01;與阿霉素組比較,#P<0.01圖4 轉染BCRP siRNA對MCF-7/ADR細胞凋亡的影響Figure 4 Effect of BCRP siRNA on apoptosis of MCF-7/ADR cells

圖5 流式細胞儀檢測細胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis of MCF/7/ADR cells by flow cytometery

2.4 轉染BCRP siRNA對MCF-7/ADR細胞PKC、p53、Bcl-2的影響

通過real time PCR檢測各組細胞BCRP信號轉導通路PKC活性及細胞凋亡相關基因p53、Bcl-2的表達變化,結果見圖6。與陰性對照組和阿霉素組比較,BCRP siRNA+阿霉素組BCRP mRNA表達顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01);PKC mRNA表達也均顯著降低(P<0.01);p53 mRNA表達均顯著增高(P<0.01);Bcl-2 mRNA表達顯著降低,差異有統計學意義(P<0.01,見圖6)。

2.5 沉默BCRP對PKC、p53、Bcl-2蛋白表達的影響

Western blot實驗結果顯示,與陰性對照組比較,BCRP siRNA組、阿霉素組、BCRP siRNA+阿霉素組BCRP、PKC、Bcl-2蛋白表達量均下調,而p53蛋白表達量上調;與阿霉素組比較,BCRP siRNA+阿霉素組BCRP、PKC、Bcl-2蛋白表達量均下調,而p53蛋白表達量上調(見圖7)。

與陰性對照組比較,*P<0.01;與阿霉素組比較,#P<0.01圖6 轉染BCRP siRNA后MCF-7/ADR細胞中BCRP、PKC、p53、Bcl-2 mRNA表達變化Figure 6 The changes of BCRP, PKC, p53, Bcl-2 mRNA expression after transfection with BCRP siRNA in MCF-7/ADR cells

3 討論

BCRP是在乳腺癌細胞系MCF7/AdrVp中發現的耐藥蛋白[7],基因位于4q22-23,編碼665個氨基酸殘基,包括16個外顯子和15個內含子,轉錄起始位點在第二個外顯子上[8];BCRP以二硫鍵連接形成同源二聚體或異二聚體的跨膜通道發揮作用。Maliepaard等[9]用抗BCRP單克隆抗體BXP-21、BXP-34研究發現,BCRP主要分布于細胞膜,在乳腺小葉、乳管、靜脈和毛細血管內皮中均有表達。在特定環境下,BCRP可從胞膜向胞質移位,即BCRP的胞質限制。研究證實BCRP參與干細胞生理功能維持、激素分泌、葉酸穩態維持、卟啉和亞鐵血紅素代謝等生理過程[10];亦可識別、轉運抗腫瘤藥物,降低胞內藥物濃度和減輕細胞毒作用,如米托蒽醌、伊立替康、甲氨蝶呤、拓撲替康、喜樹堿等[11];BCRP過表達可致腫瘤細胞系對多種抗腫瘤藥物如阿霉素、柔紅霉素等交叉耐藥[12]。研究發現,其對靶向藥物產生類似的作用;Galetti等[13]實驗結果顯示,BCRP過表達干擾Gefitinib的吸收與轉運;Kort等[14]報道BCRP可加速Ceritinib的代謝與清除,最終降低其效能。曾愛華等[15]發現BCRP基因在乳腺癌組織中陽性表達率、表達水平均高于癌旁組織,有淋巴結轉移者表達水平顯著升高;Okamura等[16]發現BCRP在肺癌組織中也廣泛表達,其過表達與肺癌預后、肺癌細胞MDR相關。Xie等[17]發現RNAi抑制人絨毛膜癌細胞中BCRP表達后化療藥物敏感性增加;楊成等[18]發現RNAi抑制BCRP基因轉錄和翻譯水平的表達,能明顯提高MCF-7/ADR對阿霉素的藥物敏感性。Jiao等[19]發現RNA-miR-181a、487a靶向抑制BCRP表達后,乳腺癌細胞對阿霉素、米托蒽醌等抗腫瘤藥物敏感性增加。陳萍等[20]發現BCRP mRNA表達水平與腋淋巴結轉移、Her-2等正相關,提示BCRP基因可預測乳腺癌侵襲轉移,由此可判斷乳腺癌生物學行為;Liang等[21]發現BCRP與肺癌的化療耐受和預后密切相關。RNA干擾可在染色質水平、轉錄水平和翻譯水平調控基因表達,有強的序列特異性和有效性;其機制主要是通過與mRNA的堿基完全互補配對,達到沉默靶基因的效應,是一種負調控機制。本實驗通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測轉染BCRP siRNA沉默BCRP,MCF-7/ADR細胞中BCRP mRNA和蛋白表達量均顯著降低;MTT檢測結果顯示,沉默BCRP能抑制MCF-7/ADR細胞增殖能力;FCM結果顯示,早期凋亡和晚期凋亡細胞數量均顯著增加。我們的實驗結果表明沉默BCRP提高乳腺癌MCF-7/ADR細胞對阿霉素的藥物敏感性。因此,BCRP作為乳腺癌化療耐藥相關蛋白,并有可能成為潛在的生物標志物,為評估腫瘤療效預測、預后等提供新的思路。

1.空白對照組;2.陰性對照組;3.BCRP siRNA組;4.阿霉素組;5.BCRP siRNA+阿霉素組;與陰性對照組比較,*P<0.01;與阿霉素組比較,#P<0.01圖7 BCRP siRNA、ADM及兩者合用對PKC、p53、Bcl-2蛋白表達的影響Figure 7 Effect of BCRP siRNA, ADM and their combination on protein expression of PKC, p53 and Bcl-2

蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)是一種多功能蛋白,廣泛參與細胞信號轉導、蛋白質磷酸化、細胞對生長因子應答等生理生化過程,在腫瘤的發生、發展中起重要作用,參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡和遷移,并且與腫瘤細胞MDR密切相關。p53基因是一種抑癌基因,定位于染色體17p13.1,基因全長約20 kb,編碼393個氨基酸組成的53 kD的核內磷酸化蛋白,即p53蛋白;p53基因分野生型和突變型兩種,具有高度的同源性和保守性。參與細胞周期調控、細胞分化與增殖、DNA修復、細胞凋亡等,并且具有抑制腫瘤血管生成的作用。目前在多種惡性腫瘤中均有研究,乳腺癌中p53的活化可抑制癌細胞增殖和促進凋亡[22,23]。細胞凋亡是一種程序化死亡過程,涉及多因素的調控,如Bcl-2蛋白質家族,包括抑制凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等關鍵蛋白[24,25]。Bcl-2蛋白過表達使得腫瘤細胞逃避凋亡、抗腫瘤藥物耐藥;因此,采用RNAi等基因調控技術或Bcl-2抑制劑,如Venetoclax等[26,27]可能使Bcl-2蛋白過表達的惡性腫瘤細胞恢復正常的凋亡通路、克服凋亡抵抗,使得對傳統化療藥物更敏感。本研究通過實時熒光定量PCR實驗檢測發現,沉默BCRP可使PKC、Bcl-2 mRNA表達均下調,而p53 mRNA表達上調;Western blot實驗檢測得知,PKC、Bcl-2蛋白表達量也顯著下調,而p53蛋白表達量顯著上調。因此,調控BCRP表達,通過調節PKC信號轉導通路,抑制細胞增殖,調節Bcl-2與p53表達來促進細胞凋亡,為提高乳腺癌多藥耐藥的藥物敏感性提供新的思路。

綜上所述,沉默乳腺癌細胞中BCRP基因通過調控PKC、Bcl-2、p53表達抑制細胞增殖,誘導凋亡,從而提高乳腺癌MCF-7/ADR細胞對阿霉素的藥物敏感性。本研究為BCRP在乳腺癌中的作用研究奠定了一定的實驗基礎,為乳腺癌多藥耐藥的臨床應用提供新的實驗依據。