?；切苋パ跄懰釋π∈竽X出血的神經保護作用及凋亡的影響

常 盼,張曉萌,于 軍,吳 娟,李 靜,趙?？?王西輝,鐵 茹,朱蕭玲

(1西安醫學院第二附屬醫院中心實驗室,西安 710038;2空軍軍醫大學西京醫院麻醉科;*通訊作者,E-mail:Caribbean-66@126.com)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是一種以高死亡率和高發病率為特征的神經疾病,每10萬人中其發病約為24.6人,死亡率約為30%-50%[1]。腦出血后繼發性腦損傷是影響腦出血患者生活質量的重要因素[2],因此,預防腦出血后繼發性腦損傷非常有價值,研究腦出血后繼發性腦損傷的分子機制可為臨床治療提供新的靶點,腦出血后神經損傷和凋亡是腦出血后繼發性腦損傷的重要病理過程[3]。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid, UDCA)是內源性膽汁酸,在過去幾十年中用于治療某些肝臟性疾病[4]。然而,近些年來已經證明UDCA及其共軛衍生物?；切苋パ跄懰?TUDCA),在調節凋亡中發揮獨特作用,尤其是在腦外傷損傷中[5],但其在腦出血損傷中的具體作用和機制仍然不清楚。為此,在本研究中,采用膠原酶Ⅶ誘導小鼠腦出血,探究TUDCA對小鼠腦出血的神經保護作用包括腦組織含水量和神經功能的影響及其對凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級8周齡雄性C57BL/6小鼠,18-20 g,購于空軍軍醫大學實驗動物中心,采用隨機對照將小鼠分為假手術組(Sham組),腦出血組(ICH組),腦出血+TUDCA 50 mg/kg處理組(ICH+TUDCA 100 mg/kg),腦出血+TUDCA 100 mg/kg處理組及腦出血+TUDCA 200 mg/kg處理組(ICH+TUDCA 200 mg/kg),每組24只,術前12 h禁食,但自由進水。

1.2 實驗試劑和儀器

TUDCA,Ⅶ型膠原酶購自美國Sigma-Aldrich公司;caspase-3活性檢測試劑盒購自中國碧云天生物科技有限公司;TRIzol及Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司,引物合成由上海生工完成,引物序列見表1。腦立體定位儀購自北京眾實迪創生物科技發展有限公司;干燥箱購自美國Thermo公司;全波長酶標儀購自美國Bio-Tek;實時熒光定量PCR購自美國Bio-Rad公司。

1.3 腦出血模型的建立及處理

小鼠腦出血模型的制備參照Takagie等[6]采用Ⅶ型膠原酶的方法。將動物麻醉后固定于立體定位儀,1 μl含0.2 U的膠原酶Ⅶ 5 min內緩慢注入右紋狀體內,注射點位于前囟前0.2 mm,深度0.3 mm處,留針5 min,拔針5 min。假手術組將1 μl的生理鹽水注入右紋狀體中,TUDCA處理組在造模前1 h和造模結束后3 h緩慢注射入模型鼠的內頸動脈。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

名稱正向引物反向引物大小(bp)Bcl-25′-AGCATGCGACCTCTGTTTGA-3′5′-GCCACACGTTTCTTGGCAAT-3′433Bax5′-TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG-3′5′-GAAGTAGGAAAGGAGGCCATC-3′167Bcl-xL5′-AGGTCGGCGATGAGTTTGAA-3′5′-CGGCTCTCGGCTGCTGCATT-3′337β-actin5′-TGCCCATCTATGAGGGTTACG-3′5′-TAGAAGCATTTGCGGTGCACG-3′640

1.4 神經功能的評估

小鼠腦出血神經功能損傷的評估分別在腦出血后1,3,5,7 d進行檢測,檢測方法采用神經功能缺損評分(NDS)來進行,具體參照何洋等[7]的方法,主要測試內容包括行走、平衡、感覺、提尾反射等。

1.5 小鼠腦組織含水量的檢測

小鼠腦組織含水量的檢測方法采用本課題組之前報道的方法[8],采用五分法檢測,即在小鼠腦出血1 d后,將小鼠腦組織分為傷側及對側皮質、傷側及對側紋狀體、小腦五部分,隨即稱重,然后放入100 ℃烘箱中烘干1 d后,取出稱重,計算腦組織含水量,腦組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重100%。

1.6 腦組織caspase-3活性的檢測

采用caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性,首先裂解組織并進行勻漿,離心取上清,加入適量的染色劑,37 ℃孵育60 min,利用酶標儀在405 nm處進行測量,計算caspase-3活性。

1.7 腦組織bcl-2、bcl-xL及bax mRNA的檢測

腦出血1 d或3 d后取腦組織,腦組織中總RNA的提取使用TRIzol試劑,反轉錄以及Real Time PCR依照Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR qRT-PCR的說明書進行操作,主要包括去除基因組DNA,反轉錄反應及Real Time PCR反應。反應條件為預變性95 ℃ 30 s,變性95 ℃ 5 s,退火56 ℃ 30 s,重復變性和退火步驟40次,解離95 ℃ 15 s。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 TUDCA對小鼠腦出血后腦組織含水量變化的影響

在小鼠腦出血1 d后,腦出血后基底節區和皮質區高于假手術組(P<0.01),經50 mg/kg的TUDCA處理后未改變腦出血后腦組織含水量(P>0.05),經100 mg/kg或200 mg/kg的TUDCA處理后,皮質區和基底節區腦組織含水量均降低(P<0.05,見圖1)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖1 各組小鼠腦出血后腦組織含水量的變化Figure 1 Changes of water content in cerebral tissue after cerebral hemorrhage in mice in five groups

2.2 TUDCA對小鼠腦出血后神經功能缺損評分結果的影響

腦出血1,3,5,7 d神經功能缺損評分顯著高于假手術組(P<0.01);腦出血1 d,50 mg/kg或100 mg/kg TUDCA未改變腦出血后神經功能缺損評分(P>0.05),而200 mg/kg TUDCA可以降低神經功能缺損評分(P<0.05);在腦出血3 d,50 mg/kg TUDCA未改變腦出血后神經功能缺損評分(P>0.05),而100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA均可以降低神經功能缺損評分(P<0.05);在腦出血5 d或7 d,50 mg/kg,100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA均未改變神經功能缺損評分(P>0.05,見圖2)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖2 各組小鼠腦出血后神經功能缺損評分結果比較Figure 2 Comparison of scores of neurological deficits after cerebral hemorrhage among five groups

2.3 TUDCA對小鼠腦出血凋亡的影響

腦出血1 d與3 d后,caspase-3的活性較假手術組顯著增加(P<0.01),50 mg/kg TUDCA未改變腦出血后caspase-3的活性(P>0.05),而100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA均可以減少腦出血后caspase-3的活性(P<0.05,見圖3)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖3 各組小鼠腦出血后caspase-3活性的改變Figure 3 Comparison of caspase-3 activity after cerebral hemorrhage in mice among five groups

2.4 TUDCA對小鼠腦出血Bcl-2家族的影響

RT-PCR結果顯示,在腦出血1 d和3 d,bcl-2和bcl-xLmRNA的表達較假手術組顯著升高(P<0.01),而bax mRNA則沒有變化(P>0.05,見圖4)。在腦出血1 d和3 d,50 mg/kg或100 mg/kg TUDCA未改變bcl-xLmRNA的表達(P>0.05,見圖4),而200 mg/kg TUDCA可降低腦出血bcl-xLmRNA的表達(P<0.05,見圖4)。在腦出血3 d,50 mg/kg,100 mg/kg及200 mg/kg TUDCA均可增加bcl-2的轉錄激活水平(P<0.05,見圖4)。

與sham組相比,**P<0.01;與ICH組相比,#P<0.05圖4 TUDCA對小鼠腦出血bax, bcl-xL以及bcl-2 mRNA水平的影響Figure 4 Effects of TUDCA on bax, bcl-xL and bcl-2 mRNA levels after cerebral hemorrhage in mice

3 討論

TUDCA在中醫有著悠久的歷史,常常被作為治療膽道和肝臟疾病的藥物。腦出血具有較高的致死率和致殘率,預后往往也較差,主要原因是由于繼發性腦損傷后引起的血腫,導致缺血、水腫和炎癥等反應,最終引起細胞死亡[9]。因此預防腦出血后水腫的進一步擴大是治療腦出血的一個有效有段,腦水腫一般可以通過腦組織含水量來衡量,本次研究中首先對腦水腫進行評估,將小鼠腦組織分為五部分分別檢測腦組織含水量,結果發現50 mg/kg TUDCA對腦組織含水量沒有影響,而100 mg/kg或200 mg/kg TUDCA可以降低腦出血后損傷側基底節區和皮質區腦水腫,結果提示腦出血后水腫形成的主要原因可能就集中在損傷側的基底節區和皮質區,說明一定濃度的TUDCA可以降低小鼠腦出血后的腦水腫程度,作用主要集中在損傷側基底節區和皮質區。為了進一步探究TUDCA對腦出血的作用,本次研究還檢測了TUDCA對小鼠腦出血后神經功能的影響,結果發現一定濃度的TUDCA處理腦出血小鼠后可以降低神經功能缺損評分,但在3 d后未發現其對神經功能缺損的影響,說明TUDCA對腦出血的作用可能主要對急性期有效。結合以上結果說明,TUDCA對小鼠腦出血損傷具有重要的神經保護作用,包括降低腦水腫和降低神經功能缺損的評分,提示TUDCA可能對包括中風等急性神經系統疾病發揮重要的作用。

腦出血后的細胞死亡涉及幾種不同途徑的復雜過程,包括細胞凋亡的發生,抑制細胞凋亡可能為治療腦出血提供新的治療方案[10]。有報道稱神經功能和水腫與凋亡的發生也密切相關[11]。為了進一步研究TUDCA對小鼠腦出血的保護機制,本次研究首先檢測凋亡指標caspase-3的變化情況,結果發現，TUDCA可以降低腦出血后caspase-3活性。Caspase-3的水平是在腦出血伴隨DNA片段化時發生的變化,TUDCA是一種有效的細胞凋亡抑制劑,可以減少大鼠急性腦出血后神經元損傷引起的細胞凋亡[12],最新的文獻報道,TUDCA對脂多糖誘導的小鼠認知功能損害和神經毒性的保護作用與凋亡密切相關[13]。TUDCA對凋亡的影響機制主要包括可以直接抑制活性氧的產生,抑制跨膜電位崩潰和線粒體外膜破壞[14],還可以通過抑制Bax從細胞質向線粒體的轉運以減輕線粒體功能不全和毒性,以及抑制細胞色素c的釋放,從而減少caspase的活化和底物裂解。此外,TUDCA還可通過阻斷凋亡途徑來抑制內質網應激誘導的細胞死亡[14,15]。但在腦出血中,TUDCA對凋亡影響的具體機制和內容仍未見報道。為了進一步探究TUDCA對凋亡的影響,我們檢測了Bcl-2家族相關基因的改變,包括促凋亡因子Bax,以及抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-xL[16],本次結果發現TUDCA未改變腦出血后bax mRNA的影響,而降低腦出血后bcl-xLmRNA的表達,增加bcl-2的轉錄激活水平。說明Bcl-2水平可能通過激活替代存活通路而保持升高。這些結果表明,Bcl-2的增加或Bcl-xL的降低與腦出血相關,TUDCA對腦出血組織的保護作用與Bcl-2和Bcl-xL相關?？傊?本研究結果表明TUDCA可以顯著減少與腦出血相關的損傷,它似乎通過激活某些存活途徑來抑制細胞凋亡。

綜上所述,TUDCA可以減輕小鼠腦出血后的腦水腫和神經功能缺損,發揮神經保護作用,其具體的機制與凋亡反應的減輕相關,本次研究為腦出血發病機制和治療的基礎研究提供新的思路。