AST和ALT參考方法在室間質評靶值中的應用

羅曉旭,秦大鵬,梁轉霞,申 彬,杜怡青,楊澤華*

(1山西醫科大學第一醫院檢驗科,太原 030001;2山西醫科大學第六醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:zehuay026@163.com)

檢驗質量是實驗室永恒的追求,而室間質量評價(EQA)則是提高實驗室檢驗質量的重要手段和環節,是以參加EQA活動的實驗室的測定值與EQA靶值的離散程度或偏差為依據來評價實驗室的檢驗能力[1]。因此在EQA計劃中靶值的設定成為一個非常關鍵的問題,關乎到是否能科學、合理地評價一個實驗室的檢驗能力,如實驗室可能因靶值建立不準確而收到假警告,浪費實驗室的財力和物力[2]。室間質量評價的靶值建立方式有以下幾種[3,4]:①已知值,其值由專門的檢測物品配制(制備或稀釋)時確定;②有證參考值,其值由定義法確定;③參考值,與一個可溯源到一個國家或國際標準的標準物質或標準并行進行分析、測量或比對檢測物品所確定的值;④從專家實驗室得到公議值;⑤按照當前水平制定的值,即從參加實驗室獲得公議值,對于定量項目具體為相同方法組的多家實驗室的測量結果在剔除離群值后的平均值或中位數作為該組靶值[5]。目前臨床檢驗中心主要是采用以上第五種方法即從參評實驗室獲得公議值作為常規生化EQA靶值,但將參評實驗室公議值作為EQA靶值存在一定風險,例如參評實驗室的檢驗水平良莠不齊,若多數實驗室檢測水平偏高或偏低,就會導致公議靶值存在一個方向的偏倚,這樣就會因靶值不準確而不能有效反映參評實驗室本身的檢驗能力。EQA標本的指定值應該使用參考測量程序或者一個能溯源到參考測量程序的高度特異的可比較的方法測定[6],從而為EQA結果的解釋提供依據以更好地發揮EQA在臨床檢驗標準化中的重要作用。ALT和AST是心臟與肝臟等多種疾病的重要診斷酶學指標,具有重要的臨床意義。因此本研究依據2002年國際臨床化學標準協會(IFCC)公布的ALT和AST參考測量程序[7,8],建立了改良參考方法[9],比較參考方法測定值與EQA公議靶值的相關性,為EQA靶值的臨床可接受性提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 ①儀器:SHIMADZU UV-2450紫外分光光度計及其配套比色皿、SHIMADZU-CPS比色杯恒溫電子控制裝置、SHIMADZU電子天平、恒溫水浴箱、pH計、Finnpipette移液器、電子溫度計、秒表、容量瓶及各種高精密度玻璃器皿;②試劑:按照國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(IFCC)推薦的AST和ALT參考測量程序配制試劑。還原型-β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)均購自Sigma公司,氯化鈉(NaCl)、疊氮鈉(NaN3)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)購自北京化工廠有限責任公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、L-丙氨酸、L-天門冬氨酸、α-酮戊二酸二鈉鹽、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白均購自上海生工生物工程技術服務有限公司。配制成反應液R1,啟動液R2。

1.1.2 樣本 2017年山西省臨床檢驗中心發放的10個質評樣本,批號為201711、201712、201713、201714、201715、201721、201722、201723、201724、201725,分別用5 ml去離子水溶解;2019年衛生部臨床檢驗中心發放的5個全國室間質評樣本,批號為201911、201912、201913、201914、201915,分別用3 ml去離子水溶解;以上質評樣本均為凍干粉樣本。

1.2 方法

1.2.1 質評樣本的溶解方法 嚴格按照質評樣本復溶要求將凍干粉質評樣本用去離子水在室溫下[(23±1)℃]溶解混勻呈均一態;開啟瓶塞時應嚴格避免凍干粉的丟失。

1.2.2 樣本檢測方法 依照IFCC參考測量程序成功建立AST和ALT改良參考方法(不加磷酸吡哆醛,正確性、精密度及線性范圍均符合要求),依照下述規定的反應條件對15個室間質評樣本的AST和ALT分別進行檢測,每個樣本的每個項目均重復測定5次。AST和ALT改良參考方法測定條件:溫度37.0 ℃±0.1 ℃,波長340 nm,頻帶寬度≤2 nm,光路10.00 mm,孵育時間360 s,延遲時間90 s,檢測時間180 s。

1.2.3 催化活性濃度的計算 依據動力學反應曲線記錄每次測定的吸光度數據,對吸光度數據進行回歸分析,計算單位時間內AST和ALT的吸光度變化,進而根據以下公式計算AST和ALT的催化活性濃度:

AST/ALT濃度=ΔA/Δt×K

1.3 統計學處理

①改良參考方法測定值:將每個樣本的AST和ALT的5次測定值取均值作為參考方法測定值;②參考方法測定值與EQA公議靶值的比較:對二者進行直線相關及回歸分析;計算AST和ALT的參考方法測定值與EQA公議靶值的相對偏倚,對二者進行偏倚評估,依據美國臨床實驗室改進修正案’88(CLIA’88)規定的1/2 TEa為評價標準,判斷是否通過。

2 結果

2.1 質評樣本的參考方法測定值及EQA靶值

每個樣本的每個項目的5次測定結果的均值作為改良參考方法測定值,靶值參照室間質量評價報告。所有批號的參考方法測定值及EQA靶值見表1。

2.2 相關及回歸分析

所有批號的EQA公議靶值及參考方法測定值的決定系數及回歸方程見表2,二者相關性良好;回歸曲線見圖1。

2.3 偏倚評估

所有批號的相對偏倚均小于美國臨床實驗室改進修正案’88(CLIA’88)規定的1/2 TEa(8%),均可被臨床所接受(見表1)。

表1 參考方法測定值與EQA公議靶值的相對偏倚

Table 1 Relative bias of the values by reference method and target values of EQA

批號ASTALT參考方法測定值(U/L)公議靶值(U/L)相對偏倚(%)參考方法測定值(U/L)公議靶值(U/L)相對偏倚(%)判斷標準20171154.4562.8659.0613.288%201712164.61724.30142.01547.798%20171318.3193.6820.7225.918%20171461.4655.5468.1714.088%201715227.02332.64193.22045.298%20172136.8383.1632.4357.438%201722194.5194-0.26101.61053.248%20172345.5461.0931.3335.158%201724196.9195-0.9796.0982.048%201725184.91902.6896.01014.958%20191195.9971.1396.6992.428%20191230.130-0.3328.5300.058%201913215.42191.64221.52282.858%201914114.61161.21110.9110-0.828%201915151.61552.19164.01650.618%

表2 EQA公議靶值及參考方法測定值的相關系數及回歸方程

Table 2 Correlation coefficient and regression equation of the target values of EQA and the determined values by reference method

樣本 項目回歸方程R22017年山西省臨檢中心室間質評樣本ASTYAST2017=1.0106X+1.10780.9988ALTYALT2017=1.0602X-0.61170.99882019年NCCL室間質評樣本ASTYAST2019=1.0219X-0.78280.9999ALTYALT2019=1.0224X-0.68230.9991

圖1 EQA公議靶值與參考方法測定值散點圖Figure 1 Scatter plot between the target values of EQA and the determined values by reference method

3 討論

室間質評活動關乎到是否能科學、合理地評價一個實驗室的檢驗能力,同時也關乎到臨床檢驗標準化的進程。目前室間質評常規化學定量項目主要采用的是同方法組靶值,這種靶值確定方法雖避免了不同檢測方法對檢驗結果互認的一部分影響,使得同方法組之間的測定結果具有可比性,同時可判斷一個實驗室是否規范使用了廠家推薦的測定程序。但是同組評價并不能建立所有實驗室檢驗結果的可比性,更不能評價測定結果的正確度[10],而準確測量的關鍵是結果需溯源到一個公認的參考物質或參考方法[11]。因此本研究通過比較參考方法對質評樣本的測定值與EQA公議靶值二者的相關性及相對偏倚,探討應用EQA公議靶值評價實驗室能力的科學性及合理性。

本研究發現公議靶值與參考方法測定值相關性良好,2017年山西省臨檢中心的10個批號的AST項目的相對偏倚為(-0.97)-5.54、ALT項目的相對偏倚為2.04-7.79,2019年衛生部臨檢中心的5個批號的AST項目的相對偏倚為(-0.33)-2.79、ALT項目的相對偏倚為(-0.82)-2.85,所有批號的相對偏倚均小于美國臨床實驗室改進修正案’8(CLIA’88)規定的1/2 TEa,均為臨床可接受。另外可以看出山西省臨檢中心的AST、ALT項目的相對偏倚較衛生部臨檢中心的大且兩種方法的相關性也較衛生部臨檢中心的小,可能存在省室間質評組織者采用的靶值確定統計方法、統計規則不規范,質評樣本運輸問題或省室間質評參加實驗室數量相對較少等其他原因而致靶值與參考方法測定值偏離較大。另外從表3可以看到,批號201712、201721的ALT項目的偏倚較大,可能是因為:①參加質評的實驗室互相溝通、數據共享,填報相近數據;②同組的參評實驗室的檢測水平多數偏低或偏高;③一個地區實驗室的校準有問題。以上3種情況都導致參評實驗室回報數據接近而掩蓋了實驗室、廠家實際存在的缺陷,此時室間質評活動并不能真正發現檢驗能力較差的實驗室。而如果采用參考方法定值作為參比,可以減少當多家實驗室出現方向一致的偏倚時所導致靶值出現的偏倚,在一定程度上提高正確性[12]。

綜上所述,EQA公議靶值與參考方法相關性滿足臨床需要,結合我國現狀,目前可暫時從參評實驗室獲得公議值作為EQA靶值,用于我國EQA計劃。同時可將參考方法測定值作為參比值,提高EQA靶值的正確度,避免因靶值設定不合理而降低EQA活動在評價實驗室檢測能力中的作用。但是僅此并不能確定實驗室測定值與靶值的偏倚是因為與基質相關的偏倚、校準偏倚還是實驗室沒有使用制造商的推薦操作程序所致的偏倚[13]。所以要想充分發揮EQA活動在評價單個實驗室、測量程序的再現性、校準溯源性以及實現實驗室之間和測量程序之間的一致性中的作用[14],最理想的質評樣本應是采用參考測量程序或可溯源至參考測量程序的方法對具有互換性的EQA標本賦值[15],但是實現這類最理想的質評樣本目前還面臨著巨大挑戰,而這需要實驗室、體外診斷行業、參考實驗室和專業組織共同承擔。