桑白皮藥材的品質檢測及質量標準

劉一涵，田云剛，郭洪偉，王建霞，魏 華，2

(1.吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000；2. 湖南省土家醫藥研究中心，湖南 吉首 416000)

桑白皮始載于《神農本草經》，原名桑根白皮，古代稱桑皮、桑根皮、白桑皮，按現代的產地命名有“亳桑皮”(亳州)、“嚴桑皮”(浙江)、“北桑皮”(江蘇).據史料考證，桑白皮原植物除了桑MorusalbaL.以外，還有蒙桑M.mongolic、華桑M.cathayana和雞桑M.australis.2015年版中國藥典收錄的桑白皮為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮[1].桑白皮性寒，味甘，歸肺經，具有瀉肺平喘、利水消腫之功，主治肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚浮腫之癥[1].現代藥理學研究表明，桑白皮具有平喘[2]、降血壓和血脂[3-4]、抗抑郁[5]、抗炎抗腫瘤[6-7]、鎮痛[8]、抗酪氨酸酶[9]、抗病毒[10]等活性，極具開發利用價值.

桑白皮作為一種常用中藥，由于其原植物桑栽培廣泛，人工雜交的品種繁多，導致市售品中，常有偽品、次品混入.同時，2015年版中國藥典中僅有桑白皮的傳統鑒別和薄層鑒別，這很難滿足全面控制藥材質量的要求.因此，制定新的桑白皮藥材質量標準刻不容緩.近年來，有關桑白皮藥材的研究多集中在其化學成分和藥理作用方面，對藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及適宜性薄層鑒別等的研究少之又少.為此，筆者采集并處理得到來自7個省的85批有確定產地及生源的桑白皮，對其水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及薄層鑒別等方面進行了研究，同時，以桑皮苷A為指標性成分進行定量測定，建立了相應的標準，并對不同產地、不同生源的桑白皮進行了差異評價,以期為桑白皮的生產、篩選及新的桑白皮藥材標準制定提供參考依據.

1 材料與方法

1.1 儀器、樣品與試藥

儀器.CAMAG SANMPLER 4型全自動點樣儀，配置25 μL點樣針；CAMAG ADC 2自動展開儀；CAMAG VISUALIZER薄層成像儀(瑞士卡瑪公司)；島津LC16型高效液相色譜(島津公司)；LE204E/02萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO)；WJX-800A多功能粉碎機(上海緣沃工貿有限公司)；101-2AB電熱鼓風干燥箱(北京中興偉業儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環式多用真空泵(上海力辰邦西儀器科技有限公司)；KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；20X1 CHIGO電陶爐(中山市順邦電器有限公司)；L530醫用離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；DZKW-D-6電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；SX-2.5-10箱式電阻爐，KSW-6-12電爐溫度控制器(邦西儀器科技有限公司)；硅膠GF254預制板(青島海洋化工廠).

樣品.85批鮮桑樹根于2017年10—11月采挖所得.不同來源的桑樹根分別收集于安徽、廣東、江蘇、湖南、河南、四川、浙江等地，各批次樣品植物標本經吉首大學張代貴教授鑒定為?？浦参锷?(MorusalbaL.).各批鮮根置于通風處，抖凈泥土，用銅刀刮去根最外層粗皮(栓皮層)，刮皮時盡量減少漿液損失，將里層白皮剝下(難剝下的用槐木錘在槐木板上輕輕敲打剝下)，再用不銹鋼切片機切成0.5～1 cm的小段，45 ℃烘干后得桑白皮，保存備用.

試劑與材料.甲醇(色譜純和分析純)；二氯甲烷(分析純)；乙酸乙酯(分析純)；鹽酸(分析純)；95%乙醇(分析純)；石油醚(分析純)；硝酸銀(分析純)；冰乙酸(色譜純)；；怡寶水；桑皮苷A標準品(成都克洛瑪生物科技有限公司)；桑辛素、桑酮G標準品(實驗室自制，純度達98%以上).

1.2 方法

1.2.1 桑皮苷A的薄層鑒別 供試品溶液的制備：稱取過二號篩的樣品粉末約0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入50 mL 70%甲醇，加熱回流40 min，放冷，過濾，濾液作為供試品溶液.

標準品溶液的制備：精密稱定桑皮苷A標準品5.0 mg，加甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶，制成質量濃度為0.2 g/L的標準品溶液.

TLC實驗：吸取供試品和標準品溶液各3～6 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-冰乙酸(1∶6∶2.5∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視.

1.2.2 桑辛素和桑酮G的薄層鑒別 供試品溶液的制備：稱取過二號篩的樣品粉末0.1 g，加25 mL 95%乙醇，超聲(100 W，40 kHz)處理30 min，離心，取上清液作為供試品溶液.

標準品溶液的制備：取桑辛素、桑酮G標準品，加95%乙醇制成二者質量濃度均為0.1 g/L的混合溶液，作為標準品溶液.

TLC實驗：吸取上述2種溶液各10～15 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰乙酸(5∶10∶1.2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視.

1.2.3 水分、總灰分及酸不溶性灰分測定[11]參照2015年版中國藥典第四部通則0832水分測定法第二法(烘干法)測定水分，參照通則2302下總灰分測定法測定總灰分，參照通則2302下酸不溶性灰分測定法測定酸不溶性灰分.

1.2.4 浸出物提取條件考察及含量測定 取X1樣品粉末，參照2015年版中國藥典第四部通則2201水溶性浸出物測定法[11]，考察熱浸法和冷浸法以及分別以體積分數為0，20%，40%，60%，80%，95%的乙醇作為提取溶劑時提取的浸出物含量差異.以浸出物含量最高的提取方法提取和測定各樣品中浸出物.

1.2.5 HPLC測定桑皮苷A含量 標準品溶液的制備：精密稱取5.5 mg桑皮苷A標準品于10 mL的容量瓶中，加7%甲醇溶解并定容，配成質量濃度為550 mg/L的標準品溶液，備用.

供試品溶液的制備：精密稱取過二號篩的500.0 mg桑白皮粉末于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL確70%甲醇，精密稱定后于80 ℃水浴回流提取40 min，冷卻稱重，并用70%甲醇補足減失的重量，4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL于10 mL容量瓶中，用純凈水定容至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得.

色譜條件：YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，檢測波長326 nm，流動相5%甲醇(A)∶甲醇(B)，梯度洗脫(0～40 min,10%B;40～41 min,10%～100%B;41～50 min,100%B; 50～51 min,100%～10%B;51～60 min,10%B).在此條件下，桑皮苷A與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，按桑皮苷A計算，理論塔板數>5 000.標準品及供試品的部分HPLC圖譜見圖1.

圖1 桑皮苷A標準品(A)和桑白皮供試品HPLC色譜圖(B)Fig. 1 HPLC Chromatograms of Mulberroside A Standard (A) and Sample (B)

線性關系考察：精密吸取桑皮苷A標準品溶液，用7%甲醇依次稀釋配制得質量濃度分別為550，330，220，110，5.5，2.75 mg/L的桑白皮苷A標準品溶液.0.45 μm微孔濾膜過濾，按1.2.5節色譜條件測定，以標準品質量濃度為縱坐標(X)，峰面積為橫坐標(Y)，進行線性回歸.

檢測限和定量限：按信噪比(S/N)約為3的標準品溶液質量濃度為檢測限(LOD)，以信噪比(S/N)約為10的標準品溶液質量濃度為定量限(LOQ).

精密度試驗：按1.2.5節色譜條件對質量濃度為100 mg/L標準品溶液連續進樣6次，計算6次桑皮苷A峰面積的RSD值.

穩定性試驗：按1.2.5節色譜條件對同一桑白皮(S16)供試品溶液分別于0，4，8，12，24，28，32，36，40，44，48 h進行分析，計算48 h內桑皮苷A峰面積RSD值.

重復性試驗：取同一批過二號篩的桑白皮(S16)粉末0.5 g，精密稱定6份，按1.2.2節方法制備供試品溶液，按1.2.5節色譜條件進行測定.計算6次重復試驗的桑皮苷A峰面積RSD值.

加樣回收實驗：精密稱定已知含量的桑白皮樣品(編號X6，已知X6中桑皮苷A質量分數為0.74%)6份，每份均為0.25 g，分別置250 mL錐形瓶中，然后分別加入桑皮苷A標準品溶液(質量濃度為0.6 g/L)3.0 mL，按1.2.2節的方法制備供試品溶液，按1.2.5節色譜條件測定，計算回收率.

樣品含量測定：分別稱取過二號篩的各批桑白皮藥材粉末0.5 g，按1.2.2節方法制備供試品溶液，按1.2.5節的色譜條件進行測定，用外標法計算各批桑白皮中桑皮苷A的含量.

2 結果

2.1 薄層鑒別結果

桑皮苷A薄層鑒別結果如圖2所示.以桑皮苷A為標準品，置紫外光燈365 nm下檢視，桑白皮供試品色譜在與標準品相應的位置上，顯現相同顏色的熒光斑點，Rf≈ 0.5，且斑點清晰，分離度較好.桑辛素和桑酮G的薄層鑒別結果如圖3所示.以桑辛素和桑酮G為標準品，254 nm下檢視，桑白皮供試品色譜在與2個標準品色譜相應的位置上，顯現2個相同的熒光斑點，桑辛素斑點Rf≈ 0.8，桑酮G斑點Rf≈0.1，分離度較好.

圖2 部分樣品中桑皮苷A薄層色譜圖(365 nm)Fig. 2 TLC of Mulberroside A in some Samples (365 nm)

圖3 部分樣品中桑辛素、桑酮G薄層色譜圖(254 nm)Fig. 3 TLC of Morusin and Kuwanon G in some Samples (254 nm)

2.2 水分、灰分、酸不溶性灰分和浸出物測定結果

85批桑白皮藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結果見表1.結果表明：85批藥材中，水分質量分數為6.38%～10.78%，平均8.21%，藥材均無生蟲或發霉現象；總灰分質量分數為3.42%～16.68%，平均7.58%；酸不溶性灰分質量分數為0.01%～9.12%，平均1.97%.酸不溶性灰分質量分數最大值與最小值相差較大，這可能與藥材前處理時帶入了少量泥土、塵沙等無極雜質有關.比較不同乙醇和不同提取方法對浸出物的影響結果，發現以水為溶劑、熱浸法提取的浸出物最多.熱浸法所得的水溶性浸出物質量分數為19.36%～40.57%，平均31.61%.

表1 桑白皮藥材信息及各批樣品各項質量分數測定結果

表1(續)

表1(續)

2.3 桑皮苷A測定結果

桑皮苷A回歸方程為Y=43 210X-285 404，r=0.999 8.結果顯示桑皮苷A標準品質量濃度在2.75～550 mg/L之間線性關系良好.桑皮苷A檢測限為0.06 mg/L，定量限為0.17 mg/L.精密度測定的RSD為0.903%，說明儀器精密度良好.穩定性測定的RSD為1.829%,表明供試品在48 h時間內穩定性良好.方法重復性測定的RSD為1.998%，表明此方法重復性良好.加樣回收率結果見表2.結果表明,平均回收率為101.35%，RSD為1.67%.以上結果RSD均小于2%，說明此方法可用于桑白皮中桑皮苷A的含量測定.HPLC測定的各批藥材中桑皮苷A質量分數為0.72%～10.50%，平均2.00%.

表2 桑皮苷A的加樣回收率試驗(n=6)

2.4 不同生源桑白皮藥材結果分析

不同生境桑白皮各測定指標平均值見表3.85批桑白皮藥材中有53批為野生，32批為栽培.整體比較野生桑白皮和栽培桑白皮的各測定指標平均值，發現栽培桑白皮中的水分、酸不溶性灰分及水溶性浸出物含量均高于野生桑白皮，野生桑白皮中總灰分和桑皮苷A含量略高于栽培桑白皮.

表3 不同生境桑白皮各各測定指標平均值

2.5 不同產地桑白皮藥材結果分析

不同產地桑白皮各測定指標平均值見表4.7個省份桑白皮的各測定指標平均值中，水分含量最高的是廣東桑白皮(9.52%)，最低的是河南桑白皮(7.69%)；總灰分含量最高的是河南桑白皮(8.05%)，最低的是廣東桑白皮(5.72%)；酸不溶性灰分含量最高的是河南桑白皮(2.58%)，最低的是廣東桑白皮(1.12%)；浸出物含量最高的是廣東桑白皮(36.94%),最低的是浙江桑白皮(26.45%).桑皮苷A含量最高的是江蘇桑白皮，四川桑白皮次之，若以桑皮苷A為指標采集桑白皮，此二省可作為首選之地.

表4 不同產地桑白皮各測定指標平均值

3 結語

2015年版中國藥典中已有的桑白皮薄層鑒別法是以對照藥材作為定性比照，且操作方法較為復雜.實驗結果表明，筆者所使用的薄層色譜方法可檢出桑白皮中桑皮苷A、桑辛素和桑酮G 3種成分，斑點清晰且操作簡便、快速，可作為桑白皮藥材的定性鑒別方法.

藥材含水量過高或過低都可導致其發生蟲害、霉變、潮解、軟化、風化、走味或其他質變[12].總灰分代表中藥材礦物質或雜質,酸不溶性灰分代表中藥材中的泥沙或微量氧化硅,浸出物可充分反應藥材的內在質量. 各指標性成分是中藥材藥效質量的重要保證，直接影響藥材有效成分，從而影響其臨床療效.這些指標可作為中藥材質量控制指標. 2015年版中國藥典中缺乏桑白皮質量檢測指標及其控制標準，同時，筆者未見國內關于桑白皮藥材的水分、灰分和浸出物測定的文獻報道.本文首次使用藥典法對桑白皮藥材品質進行檢測，結果表明，不同批次桑白皮藥材差異較大，綜合分析，應為桑白皮產地、生長環境及生長期限等因素所導致.因此，在質量標準中設定各檢測指標限度可直接影響藥材質量及供求關系，適度的標準可在控制藥材質量的同時，充分利用藥材資源.

筆者除了考察文中新采集的85批桑白皮藥材的水分以外，還另外檢測了2013—2016年的6批桑白皮藥材，發現含水7.06%～12.26%，均未出現霉變情況.因此，建議桑白皮水分含量以質量分數不超過13%為宜.按不超過測定平均值的120%的限度[13]，建議桑白皮總灰分質量分數不超過9.0%，酸不溶性灰分質量分數不超過2.5%.按不低于測定平均值的80%限度[13]，建議桑白皮水溶性浸出物質量分數不低于25%.按合格品桑皮苷A不低于80%限度[13]，建議桑白皮中桑皮苷A物質量分數不低于0.91%.