干旱脅迫下不同中間砧對“岳冠”蘋果葉片光合特性及葉綠素熒光特性的影響

里程輝，劉 志，王 宏，于年文，王 杰，張秀美，李宏建，宋 哲

(遼寧省果樹科學研究所，遼寧 營口 115009)

果樹受到干旱脅迫時葉片氣孔關閉，葉肉細胞損傷，這些生理反應導致植物光合速率下降。通過光合相關指標的變化趨勢，也可以反映植物在干旱脅迫下生長受到的影響程度。同樣，嫁接也對果樹的光合作用產生影響，并且不同砧穗組合間影響不同。隨著光合作用的深入研究，利用葉綠素熒光動力學方法可以快速、靈敏、無損傷地研究和探測各種逆境對植物光合生理的影響[1]，能夠提供植物光合器官結構和功能的豐富信息[2]，特別是快速葉綠素熒光誘導動力學曲線分析方法的出現，能夠快速、無損地分析逆境脅迫下PSⅡ反應中心能量捕獲及 PSⅡ供體側和受體側電子傳遞變化[3]。前人利用該技術已在果樹[4-7]、蔬菜[8]、玉米[9]等多種逆境研究中取得了一定結果。

近幾年，蘋果的矮化密植栽培方式因其產量高、品質優、早果早產、生產管理方便等優點，已成為我國蘋果產業的發展方向和趨勢?！霸拦凇?寒富×岳帥)是由遼寧省果樹科學研究所雜交選育的蘋果新品種，該品種在冷涼地區發展比“寒富”更有優勢；“遼砧2號”(助列涅特×M9，引自遼寧省果樹科學研究所)、“GM256”(紅海棠×M9，引自吉林省農業科學院果樹研究所)、“77-34”(M9×小黃海棠，引自遼寧省果樹科學研究所)是3種適合在冷涼地區栽培的矮化、半矮化砧木，以山定子為基砧，這3種砧木為中間砧與“岳冠”嫁接后親和性良好。蘋果生長不僅受砧穗組合的影響，也受環境因素影響，我國大多數果園立地條件較差，干旱是限制其高產優質的重要因子之一。因此，為了弄清干旱脅迫對不同砧穗組合蘋果的作用機制，本試驗系統研究了干旱脅迫條件下不同中間砧對“岳冠”盆栽樹葉片光合特性、葉綠素熒光誘導動力學參數及動力學曲線(OJIP)的影響，同時對部分光系統Ⅰ(PSⅠ)的關鍵參數進行探討，旨在全面反映在干旱脅迫條件下各砧穗組合對“岳冠”光合性能的影響，篩選適宜干旱地區栽培的砧穗組合，以期為生產實踐提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗于2017年6月至7月在沈陽農業大學果樹栽培與生理生態試驗基地(123°341′E，41°491′N)進行。供試的盆栽苗接穗品種為“岳冠”，基砧為山定子(Malusbaccata)，中間砧分別為遼砧2號、GM256和77-34，基砧接口粗度1.5 cm左右，嫁接高度為10 cm，中間砧段長25 cm，2016年3月采用舌接方式進行嫁接，包括岳冠/遼砧2號/山定子(YG/L2/Mb)、岳冠/GM256/山定子(YG/GM256/Mb)、岳冠/77-34/山定子(YG/77-34/Mb)和岳冠/山定子(YG/Mb)4種砧穗組合；嫁接后在溫室內進行常規管理，管理水平一致。試驗用盆采用口徑30 cm，高30 cm的異形耐老化塑料營養缽；營養土為園土棕壤，質地為粘壤土，有機質含量14.25 g·kg-1，堿解氮78.39 mg·kg-1，速效磷25.82 mg·kg-1，速效鉀178.21 mg·kg-1，pH值6.8。每種砧穗組合選擇長勢一致的2 a生盆栽苗20株，為保證在同一時間測定各參數，根據之前所做盆栽土壤含水量預試驗，從2017年6月20日開始，分時段進行處理，處理前充分灌水，即所需水量為土壤水分飽和狀態的持水量。設置以下處理：正常供水為對照(CK)，輕度干旱脅迫(LD)，中度干旱脅迫(MD)和重度干旱脅迫(HD)，土壤含水量分別為田間持水量的75%，55%，40%和30%。2017年7月16日各處理達到處理指標后，統一進行葉片光合參數和葉綠素熒光參數測定，測定位置在中心干延長頭當年新稍第6～8片成熟無病蟲葉，測定后將葉片帶回實驗室，清洗并用吸水紙吸干，用于葉綠素含量的測定，設5次生物學重復。

1.2 葉片光合參數的測定

葉片葉綠素含量測定參考李合生[10]的方法。光合參數采用英國PP-system公司的CIRAS—Ⅱ型便攜式光合系統在上午9∶00～11∶00進行測定。測定時LED光源設為1200Lux，凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)等參數均采用儀器自控系統控制；根據WUE=Pn/Tr計算水分利用效率。

1.3 葉片葉綠素熒光參數的測定

采用英國Hansatech公司生產的M-PEA多功能植物效率儀進行葉綠素熒光參數及快速葉綠素熒光誘導動力學曲線(OJIP)的測定，測定前葉片充分暗適應25 min,重復10次。所得熒光參數如下：暗適應后的初始(最小)熒光強度(Fo)；最大熒光強度(Fm)；最大光化學效率Fv/Fm；PSⅡ的潛在活性Fv/Fo；照光2 ms時的熒光強度(FJ)；照光30 ms時的熒光強度(FI)；照光t時間的可變熒光強度Vt=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)；K點的相對可變熒光WK；J相相對可變熒光VJ；單位面積吸收的光能ABS/CSm=Fm；單位面積捕獲的光能TRo/CSm；單位面積電子傳遞的量子產額ETo/CSm；單位面積內反應中心的數量RC/CSm；以吸收光能為基礎的性能指數PIabs；綜合性能指數PItotal等。

利用Microsoft Excel 2010和SPSS 17.0對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片葉綠素含量的影響

從圖1A和圖1C可以看出，在正常供水(CK)條件下，3種矮化中間砧組合葉片中葉綠素a和葉綠素a+b含量顯著高于YG/Mb組合，輕度干旱脅迫(LD)時，各砧穗組合間差異不顯著，進入中度(MD)和重度(HD)干旱脅迫時，YG/77-34/Mb和YG/Mb組合顯著高于YG/L2/Mb和YG/GM256/Mb組合，且在MD時，YG/Mb組合葉片中葉綠素a+b含量顯著高于YG/77-34/Mb組合；另外，在MD時，各組合葉片中葉綠素a和葉綠素a+b含量比CK和LD顯著降低，進入HD時，比MD顯著降低。各砧穗組合葉片中葉綠素b含量在不同干旱脅迫條件中差異不顯著(圖1B)；進入MD時，顯著低于CK和LD，進入HD時，YG/Mb組合與MD差異不顯著，其他3種矮化中間砧組合顯著低于MD。

注：圖中小寫字母表示同處理不同砧穗組合間差異顯著，大寫字母表示同砧穗組合不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Different lowercase letters mean significant difference among the same treatments and different stion; capital letters mean significant difference among the same stion and different treatments (P<0.05), the same below.圖1 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片葉綠素的影響Fig.1 Effects of different stion on Chlorophyll of leaves under water stress

2.2 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片光合特性的影響

由圖2A可以看出，不同砧穗組合“岳冠”葉片凈光合速率(Pn)對干旱脅迫的響應程度不同，在LD時，各砧穗組合葉片的Pn與對照相近，但MD和HD時，顯著低于CK和LD；在LD時，各組合差異不顯著，進入MD和HD時，YG/Mb組合最高，其次是YG/77-34/Mb組合，在MD時顯著高于YG/L2/Mb組合，在HD時顯著高于其他兩個矮化中間砧組合。各砧穗組合的氣孔導度(Gs)和蒸騰速率(Tr)在不同干旱脅迫條件下變化趨勢與Pn相同(圖2B、圖2C)，呈逐漸降低的趨勢，MD與HD間差異不顯著，其他干旱脅迫間均差異顯著；在MD時，YG/Mb組合的Gs和Tr顯著高于其他3種矮化中間砧組合，而上述3種矮化砧組合間無顯著差異；在HD時，YG/Mb和YG/L2/Mb組合的Gs和Tr顯著低于另兩種組合。各砧穗組合的胞間CO2濃度(Ci)變化趨勢與前三者相反(圖2D)，在HD時，YG/Mb比其他組合顯著降低。各砧穗組合的水分利用效率(WUE)在不同干旱脅迫下差異較大(圖2E)，由高到低依次為：LD>CK>MD>HD；YG/Mb組合只有在HD時高于其他3種矮化中間砧組合，在CK、LD和MD時均低于該3種矮化中間砧組合。

2.3 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片葉綠素熒光參數的影響

2.3.1 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片Fo、Fv/Fm和Fv/Fo的影響 從表1可以看出，隨著干旱脅迫加劇，4種砧穗組合葉片的PSⅡ反應中心受到不同程度的破壞或失活，導致Fo增加；各砧穗組合在輕度干旱脅迫與對照間差異不顯著， YG/GM256/Mb組合Fo值顯著低于其他3種組合；進入中度和重度干旱脅迫后，YG/GM256/Mb和YG/L2/Mb組合的Fo值比對照分別上升19.7%、10.3%和43.1%、25.8%，YG/77-34Mb和YG/Mb組合上升幅度較小，分別為8.0%、5.3%和10.6%、15.0%。各砧穗組合在對照和輕度干旱脅迫時，Fv/Fm和Fv/Fo值均在0.82和4.9以上，且無顯著差異；進入中度和重度干旱脅迫后，各組合的Fv/Fm和Fv/Fo值迅速下降，且與對照和輕度干旱脅迫差異顯著；進入重度干旱脅迫后，YG/L2/Mb組合的Fv/Fm值最低(0.42)，顯著低于其他3種組合，比對照下降幅度最大(49.3%)，其他3種組合間差異不顯著，比對照下降8.8%～17.2%；Fv/Fo值也是YG/L2/Mb組合最低，其次是YG/GM256/Mb和YG/77-34Mb組合，YG/Mb組合最高，4種組合分別比對照下降了85.3%、54.9%、45.5%和38.0%，且差異顯著；4種砧穗組合PSⅡ潛在活性下降情況依次為YG/L2/Mb>YG/GM256/Mb>YG/77-34Mb>YG/Mb。

2.3.2 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片快速熒光誘導動力學曲線的影響 如圖3所示，經過不同干旱脅迫處理后，4種砧穗組合葉片快速葉綠素熒光誘導動力學曲線發生明顯的變化。在CK和LD時，各砧穗組合在300μs的熒光強度(Fk)(11 000左右)和2 ms的熒光強度(Fj)(25 000左右)無顯著差異，進入MD和HD后，Fk和Fj值顯著升高，分別達到了16 000和30 000左右，說明中度和重度干旱脅迫增加了4種砧穗組合的Fk和Fj值。另外，在CK時，各砧穗組合O-J相變化無明顯差異；經過LD后，YG/L2/Mb組合的J-I相拐點開始逐漸消失，且I點和P點的熒光產額顯著低于其他3種砧穗組合，而其他3種組合間P點熒光產額以YG/Mb組合最高；進入MD后，曲線J-I相的表現為：YG/Mb組合具有較明顯拐點，YG/77-34/Mb組合的拐點逐漸消失，而YG/L2/Mb和YG/GM256/Mb組合的拐點已經消失，P點熒光產額YG/Mb組合高于YG/77-34/Mb組合；當達到HD時，3種矮化中間砧組合的曲線J-I-P相趨于平緩，拐點消失，只有YG/Mb組合的曲線J-I-P相存在模糊拐點；以上結果表明在3種干旱脅迫條件下，YG/Mb組合光合機構的破壞程度最低，其次是YG/77-34/Mb組合，YG/L2/Mb組合破壞程度最重。

表1 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片Fo、Fv/Fm和Fv/Fo的影響

注: 表中小寫字母表示同處理不同砧穗組合的差異顯著，大寫字母表示同砧穗組合不同處理的差異顯著(P<0.05)，下同。

Notes: Different lowercase letters mean significant difference among the same treatments and different stion; capital letters mean significant difference among the same stion and different treatments (P<0.05), the same below.

2.3.3 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片WK、VJ、PIabs和PItotal的影響 從表2可以看出，隨著干旱脅迫加劇，4種砧穗組合葉片的WK和VJ值升高；正常供水時，各砧穗組合的VJ值無顯著差異；經過輕度干旱脅迫后，YG/L2/Mb組合的WK和VJ值顯著高于其他3種組合，并比對照上升36.7%和22.9%，VJ值顯著高于CK；達到中度干旱脅迫時，YG/L2/Mb組合的WK和VJ值上升幅度最大，分別比對照上升了125.6%和62.9%，其次是YG/GM256/Mb組合，比對照上升了78.3%和58.8%，YG/Mb組合上升幅度最小，為21.1%和27.8%；進入重度干旱脅迫后，各砧穗組合的WK和VJ值比對照上升幅度均超過了93.0%和69.4%，但仍然是YG/L2/Mb組合最高，YG/Mb和YG/77-34/Mb組合最小。各砧穗組合的PIabs和PItotal值在輕度干旱脅迫與對照間差異不顯著；經過中度干旱脅迫后，YG/L2/Mb組合下降幅度最大，分別比對照下降70.8%和76.6%，其次是YG/GM256/Mb組合，分別比對照下降67.7%和73.7%，YG/Mb和YG/77-34/Mb組合最小，分別比對照下降了56.7%、61.7%和58.0%、67.1%；進入重度干旱脅迫后，4種砧穗組合均比對照下降了80%以上，且各砧穗組合間的PIabs值存在顯著差異，大小依次為YG/Mb>YG/77-34Mb>YG/GM256/Mb>YG/L2/Mb組合，YG/Mb和YG/77-34Mb組合間的PItotal值無顯著差異，但與其他兩種組合差異顯著。

圖3 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片快速熒光誘導動力學曲線的影響Fig.3 Effects of different stion on the fast chlorophyll fluorescence induction dynamics of leaves under water stress

處理 Treatment砧穗組合 StionWKVJPIabsPItotal對照ControlYG/L2/Mb0.11±0.006bC0.35±0.02aD7.26±0.61aA6.92±0.14aAYG/GM256/Mb0.11±0.008bC0.34±0.01aC7.45±0.40aA6.89±0.24aAYG/77-34/Mb0.14±0.007aC0.34±0.01aC6.95±0.19aA6.70±0.16aAYG/Mb0.13±0.009aC0.36±0.01aC6.86±0.35aA6.88±0.21aA輕度干旱脅迫Slight water stressYG/L2/Mb0.15±0.003aC0.43±0.02aC6.39±0.44aA6.51±0.21aAYG/GM256/Mb0.11±0.009bC0.36±0.01bC6.98±0.51aA6.46±0.30aAYG/77-34/Mb0.13±0.009bC0.35±0.01bC6.64±0.29aA6.52±0.09aAYG/Mb0.13±0.010bC0.36±0.01bC7.20±0.60aA6.96±0.08aA中度干旱脅迫Medium water stressYG/L2/Mb0.25±0.010aB0.57±0.02aB2.12±0.14cB1.62±0.02cBYG/GM256/Mb0.19±0.005bB0.54±0.03abB2.41±0.14bB1.81±0.05cBYG/77-34/Mb0.18±0.009bcB0.49±0.01bB2.92±0.18abB2.21±0.06bBYG/Mb0.16±0.006cB0.46±0.02bB2.97±0.11aB2.63±0.12aB重度干旱脅迫Severe water stressYG/L2/Mb0.33±0.015aA0.68±0.04aA0.20±0.00dC0.11±0.00cCYG/GM256/Mb0.31±0.006abA0.62±0.04bA0.65±0.02cC0.31±0.01bCYG/77-34/Mb0.29±0.016bcA0.62±0.04bA0.72±0.01bC0.95±0.04aCYG/Mb0.26±0.004cA0.61±0.03bA1.24±0.02aC0.90±0.01aC

2.3.4 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片單位橫截面積能量流參數和反應中心密度的影響 從表3可以看出，在正常供水條件下，YG/GM256/Mb組合葉片單位面積吸收的光能(ABS/CSm)、捕獲的光能(TRo/CSm)、用于電子傳遞的能量(ETo/CSm)和反應中心的數量(RC/CSm)顯著低于其他3種砧穗組合；輕度干旱脅迫增加了4種砧穗組合葉片3種能量流參數和反應中心密度，其中YG/GM256/Mb組合的3種能量流參數和反應中心密度仍顯著低于其他3種砧穗組合，YG/L2/Mb組合的ABS/CSm、TRo/CSm和RC/CSm比對照顯著提高；而中度和重度干旱脅迫降低了各砧穗組合的3種能量流參數和反應中心密度，各砧穗組合3種能量流參數和反應中心密度受損程度依次為：YG/L2/Mb>YG/77-34Mb>YG/GM256/Mb>YG/Mb組合。

表3 干旱脅迫下不同砧穗組合對葉片單位橫截面積能量流參數和反應中心密度的影響

3 討 論

3.1 干旱脅迫影響不同中間砧蘋果葉片的光合特性

葉片中光合色素含量直接影響植物光合能力，其中以葉綠素a最為重要。有研究表明，植物遭受干旱脅迫時，葉片中葉綠素含量大幅降低[11]，本研究中(圖1)，輕度干旱脅迫時，3種矮化中間砧組合與對照無顯著差異，中度和重度干旱脅迫后，各砧穗組合葉片葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量迅速下降，可能干旱直接導致葉綠素降解或造成植株吸收營養元素困難引起缺素癥狀，使葉綠素含量降低，其中YG/Mb和YG/77-34/Mb組合在中度和重度干旱脅迫的受損程度輕于YG/L2/Mb和YG/GM256/Mb組合。

研究表明，一般在干旱后期非氣孔限制因素是限制Pn的主要因素[12-13]，主要表現在羧化效率下降，Rubisco活性降低或是再生能力減弱；干旱脅迫使碳同化速率降低，Pn下降，從而導致光能過剩和產生光合作用光抑制[14]；何亞南[15]對1a生矮化自根砧和中間砧‘富士’研究認為，在中度和重度干旱脅迫下，‘M26’ 作中間砧Pn值高于‘M26’作自根砧；本試驗研究結果表明(圖2)：在中度和重度干旱脅迫時，各砧穗組合的Gs顯著低于對照，從而影響植物對CO2的同化和對水分的利用，使葉片Pn和WUE下降，光合碳同化作用受阻，但Ci濃度升高，所以此時影響光合的因子主要是非氣孔限制，并且Pn值隨著矮化性的增加而降低，這與前人的研究結果一致；同時在中度干旱脅迫且Ci濃度相同條件下，YG/Mb和YG/77-34/Mb組合的Gs和Tr高于其他組合，使Pn值較高，說明YG/Mb和YG/77-34/Mb組合受氣孔限制因素更小一些。

3.2 干旱脅迫影響不同中間砧蘋果葉片的PSⅡ反應中心活性及電子傳遞

葉綠素熒光技術是光合作用的探針，通過熒光參數可以分析光合機構內部一系列重要的調節過程。PSⅡ位于類囊體膜上，是光合機構對環境脅迫的敏感部位，是光抑制的原初位點[16]。初始熒光Fo是判斷PSⅡ反應中心運轉情況的重要指標，其增加表明PSⅡ反應中心受到破壞或失活[17]；最大光化學效率Fv/Fm是反映PSⅡ活性中心光能轉換效率的重要參數[18-21]，Schansker和Rensen發現[22]，大于0.44時，PSⅡ活性隨Fv/Fm的降低而下降，用于光合電子傳遞的能量減少，小于0.44時完全失去活性；Fv/Fo反映PSⅡ的潛在活性，與Fv/Fm是光化學反應狀況評價的重要參數[23]。本試驗研究結果表明(表1)：各砧穗組合在輕度干旱脅迫與對照無顯著差異，進入中度和重度干旱脅迫后，Fo、Fv/Fm和Fv/Fo分別迅速上升和下降，說明各砧穗組合葉片類囊體膜結構發生變化，PSⅡ反應中心受到破壞，光合作用原初反應過程受抑制，電子由PSⅡ反應中心向QA、QB及PQ庫傳遞均受到抑制，可能引起 D1蛋白降解[24]，其中YG/Mb和YG/77-34/Mb組合受到破壞程度低于另兩種組合，另外YG/L2/Mb組合的Fv/Fm值在重度干旱脅迫時為0.42，說明PSⅡ活性中心遭受不可逆失活。

光合性能指數PIabs是以吸收光能為基礎的性能指數，主要反映PSⅡ反應中心效率，有研究認為，PIabs對某些脅迫所反映植物光合機構的狀態比Fv/Fm更敏感，可以綜合評價葡萄的抗旱性[6,28-29]；但不能反映光系統Ⅰ(PS-Ⅰ)反應中心轉化情況；綜合性能指數PItotal能進一步反映電子在 PSⅡ和PSⅠ之間傳遞能力及 PSⅠ的相關性能[30]；ABS/CSm、TRo/CSm、ETo/CSm和RC/CSm分別表示葉片單位面積吸收的光能、單位面積捕獲的光能、單位面積電子傳遞的量子產額和單位面積內反應中心的數量。本研究中，各砧穗組合的PIabs、Fv/Fm和PItotal的變化對干旱脅迫都比較敏感，在中度和重度干旱脅迫時，下降幅度均較大，說明中度和重度干旱脅迫不僅使PSⅡ反應中心受到傷害，同時也使PSⅠ的功能遭到破壞；另外也降低了3種能量流參數和反應中心密度(表3)，其中受損程度依次為YG/L2/Mb>YG/GM256/Mb>YG/77-34/Mb>YG/Mb組合。

4 結 論

在輕度干旱脅迫時，4種砧穗組合無顯著差異；隨著水分脅迫程度增加，各組合葉片的氣體交換參數受到影響，PSII和PSI活性下降，導致光合特性受到抑制，3種矮化中間砧組合在中度干旱脅迫時，77-34組合受破壞較輕，抗旱性最好，遼砧2號組合破壞最重，GM256組合介于二者之間；在重度干旱脅迫時，77-34組合抗旱性最好。因此在遼寧氣候較干旱地區，如果采用矮砧密植栽培方式，利用幼樹建蘋果園可以優先考慮YG/77-34/Mb組合。