高透明度瓊脂的制備工藝研究

1234*倪 輝1234朱艷冰1234肖安風1234李清彪1234

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室,福建廈門 361021;3.廈門市食品生物工程技術研究中心,福建廈門 361021;4.廈門南方海洋中心海藻資源化深加工利用利用重點實驗室,福建廈門 361021)

瓊脂又名瓊膠,是從江蘺等紅藻中提取出來的一種多糖[1],是目前世界上用途最廣泛的海藻膠之一[2]。瓊脂是以多糖的形式存在于紅藻細胞壁的細胞間隙中,可加熱水提取并脫水制備而得[3]。經對瓊脂的組成結構進行系統研究之后,發現瓊脂是由瓊脂糖和瓊脂膠兩部分組成[4],其中具有凝膠作用的是瓊脂糖,而瓊脂膠沒有凝膠作用。目前,瓊脂廣泛應用于食品、生化醫藥及農業領域中。在食品行業中,瓊脂主要用于制作果凍、酸奶、軟糖、冰激凌和蛋黃醬穩定劑、面包膨松劑,以及增加飲料食品粘度、賦予粘滑口感、或作為食品包裝材料等作用[5-6]。在生物醫藥領域,瓊脂主要應用在凝膠電泳、色譜分離、細胞培養、細菌檢驗等方面[7]。

透明度是瓊脂產品的重要品質指標,其對微生物菌落觀察的準確性具有重要影響,并且是決定飲料和果凍產品透明度的關鍵因素。雖然人們對瓊脂的結構進行了深入研究,但對瓊脂透明度的影響因素及控制透明度的技術尚未充分研究。目前,人們常采用增強瓊脂親水性的方式來增加其透明度,如烷基化法、羧烷基化法和縮水甘油醚改性法等。烷基化法與羧烷基化法只有在特定位置的C上取代的衍生物才有效增強其親水性。在縮水甘油醚改性法中,瓊脂分子支鏈性質不同會直接影響改性后的親疏水性[8]。這些弊端導致瓊脂產品的透明度不穩定,影響了果凍等食品的品質及微生物菌落觀察的穩定性。目前,國外已經生產制備了質量穩定的高透明度瓊脂,但國內尚未研究該類技術,導致相關產品大量依賴進口[9-10]。

基于以上研究現狀,本論文通過對各類瓊脂的質量指標進行對比分析,確定高透明度瓊脂的質量指標;在此基礎上,采用在羧甲基化法進行實驗,因為這種方法作為C2羧烷基,其取代反應是隨即進行的,不會改變瓊脂基本骨架結構,是最有效的引入親水基團的改性方法[11]。但羧甲基化法在提高透明度的同時,會使瓊脂的凝膠強度下降明顯,所以實驗以普通國產瓊脂為原料,將透明度和凝膠強度同時作為質量指標,對制備高透明度瓊脂工藝進行研究,以開發達到或超過國外同類產品透明度質量指標并且保持高凝膠強度的瓊脂產品,為高透明度瓊脂的國產化提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

國產瓊脂(包括瓊脂17090201、瓊脂BD18062702、瓊脂BD18041704、瓊脂18040302、瓊脂LX18020701、瓊脂JKW18020703、瓊脂JKW18030201、瓊脂GF8017121805、瓊脂GF8018020803、瓊脂BD18040302等) 福建綠麒食品有限公司;NaBH4、無水Na2SO4國藥集團化學試劑有限公司;進口瓊脂A1296、A6606 Sigma有限公司;氯乙酸 成都艾科達化學試劑有限公司;NaOH、冰醋酸、乙醇、95%酒精 西隴化工股份有限公司。

FE20K型酸度計 瑞士梅特勒-托利多公司;BS233S 型電子天平 北京德國賽多利科學儀器有限公司;MS-H-Pro+型加熱磁力攪拌器 北京大龍興創實驗儀器有限公司;7200型分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;WSB-2白度儀 上海昕銳儀器有限公司;WNB22型數顯恒溫水浴鍋 上海美墨爾特貿易有限公司;ZXRD-B5210烘箱 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 國產瓊脂和進口高透明度瓊脂的品質指標 對比分析瓊脂BD18062702、瓊脂BD18041704、瓊脂18040302、瓊脂Sigma A6066、瓊脂Sigma A1296的凝膠強度、透明度、濁度和白度,找出透明度最高的瓊脂產品及其品質參數,并分析其他瓊脂與高透明度瓊脂的品質差異。

1.2.2 高透明度的瓊脂制備工藝 將25 g瓊脂17090201(凝膠強度1188.0 g/cm2、透明度89.2%),37.5 g無水Na2SO4、4.3 g NaBH4和14 g NaOH分散于200 mL水中,50 ℃攪拌20 min;再加入200 mL質量分數為10%的NaOH溶液,攪拌45 min;加入適量氯乙酸,在適當的溫度下攪拌反應一定時間后抽濾去除反應液,濾渣用1000 mL水攪拌清洗4次至pH為7.0～8.5,再次分散在1000 mL水中,并用冰醋酸調節pH,攪拌30 min,抽濾去除水后用1000 mL乙醇浸泡30 min,抽濾去除乙醇,65 ℃干燥120 min,粉碎過80目篩備用。

1.2.3 瓊脂及氯乙酸加入方式對瓊脂凝膠強度和透明度的影響 試驗兩種瓊脂加入的工藝:(a)先溶解試劑再加入瓊脂粉的工藝:將無水Na2SO4、NaBH4、和NaOH溶解后,再加入瓊脂粉。(b)先加入瓊脂粉再溶解其他試劑:將瓊脂粉與無水Na2SO4分散在水中后,再加入NaBH4和NaOH。

對比兩種氯乙酸加入的工藝:工藝Ⅰ:將0.36 g/g氯乙酸溶于10 mL水中,每隔5 min分四次等量加入,每次加入0.25 mL。工藝Ⅱ:將0.36 g/g氯乙酸溶于10 mL水中,每隔10 min分兩次等量加入,每次加入5 mL。

浮游動物樣品采集，數量及生物量計算均參照《淡水浮游生物調查技術規范》執行[3]。各常規理化因子包括氨氮（NH3-N）、水溫（WT）和透明度（SD）、高錳酸鹽指數（CODMn）、總磷（TP）、總氮（TN）、葉綠素 a（Chla）、溶解氧（DO）測定均參照《水和廢水監測分析方法》(第四版)進行檢測。

按照1.2.2的工藝分別采用上述瓊脂及氯乙酸加入方式,進行交叉組合,在50 ℃反應50 min,用冰醋酸調節pH=6.0后清洗干燥,制備得到反應后的四種樣品。樣品A采用工藝Ⅱ(b);樣品B采用工藝Ⅰ(b);樣品C采用工藝Ⅱ(a);樣品D采用工藝Ⅰ(a)。測定各樣品的瓊脂凝膠強度和透明度。

1.2.4 反應溫度對瓊脂透明度和凝膠強度的影響 將無水Na2SO4和NaOH等試劑溶解后,再加入瓊脂17090201,并取0.38 g/g氯乙酸溶于10 mL的水中,分成兩份間隔10 min添加進入反應體系。按照1.2.2的工藝分別在40、45、50、55 ℃的條件下反應50 min,用冰醋酸調節pH=6.0后清洗干燥,制備得到反應后的樣品,測定各樣品的瓊脂凝膠強度和透明度。研究反應溫度對瓊脂凝膠強度和透明度的影響。

1.2.5 氯乙酸添加量對瓊脂透明度和凝膠強度的影響 將無水Na2SO4和NaOH等試劑溶解后,再加入瓊脂17090201,并分別取0.34、0.36、0.38、0.40 g/g 氯乙酸溶于10 mL的水中,分成兩份間隔10 min添加進入反應體系。按照1.2.2的工藝。在50 ℃反應50 min,用冰醋酸調節pH=6.0后清洗干燥,制備得到反應后的樣品,測定各樣品的瓊脂凝膠強度和透明度。研究氯乙酸添加量對瓊脂凝膠強度和透明度的影響。

1.2.6 反應時間對瓊脂透明度和凝膠強度的影響 將無水Na2SO4和NaOH等試劑溶解后,再加入瓊脂17090201,并取0.38 g/g氯乙酸溶于10 mL的水中,分成兩份間隔10 min添加進入反應體系。按照1.2.2的工藝在50 ℃的條件下,分別反應20、35、50、65 min,用冰醋酸調節pH=6.0后清洗干燥,制備得到反應后的樣品,測定各樣品的瓊脂凝膠強度和透明度。研究反應溫度對瓊脂凝膠強度和透明度的影響。

表1 國產瓊脂和進口高透明度瓊脂的質量對比Table 1 Comparison of the qualities of domestic agars and imported high-transparent agars

注:同列不同小寫字母表示差異顯著差異(P<0.05);表2同。1.2.7 清洗pH對瓊脂透明度和凝膠強度的影響 將無水Na2SO4和NaOH等試劑溶解后,再加入瓊脂17090201,并取0.38 g/g氯乙酸溶于10 mL的水中,分成兩份間隔10 min添加進入反應體系。按照1.2.2的工藝在50 ℃的條件下反應50 min,用冰醋酸分別將體系pH調到4.0、5.0、6.0、7.0。然后清洗干燥,制備得到反應后的樣品,測定各樣品的瓊脂凝膠強度和透明度。研究不同pH對瓊脂凝膠強度和透明度的影響。

1.2.8 不同原料瓊脂對高透明度瓊脂凝膠強度、透明的和濁度的影響 分別取25 g不同批次的原料瓊脂(瓊脂LX18020701、瓊脂JKW18020702和瓊脂JKW18030201),在氯乙酸添加為0.38 g/g(間隔時間10 min分兩次添加)的情況下,50 ℃反應50 min,用冰醋酸調節pH=5.0后清洗干燥,制備得到反應后的樣品,測定各樣品的凝膠強度、透明度與濁度。

1.2.9 指標測定

1.2.9.1 透明度的測定 稱取1.5 g瓊脂倒入500 mL的燒杯內,加入100 mL水,加熱至沸騰使瓊脂完全溶解,補足加熱損失的水份,冷卻至85 ℃,倒入比色皿中,用蒸餾水調零,在750 nm下測定透明度(T)。

1.2.9.2 凝膠強度的測定 稱取1.5 g瓊脂樣品,置于500 mL的燒杯中,加入100 mL水,加熱至沸騰使瓊脂完全溶解,補足加熱損失的水份,倒入培養皿中,冷卻凝固后用保鮮膜包裹防止水分流失,室溫冷卻12 h,采用水壓法測定凝膠強度[12]。

1.2.9.3 白度的測定 將瓊脂樣品過80目篩,用白度儀測定白度。

1.2.9.4 濁度的測定 稱取1.5 g瓊脂樣品,置于500 mL的燒杯中,加入100 mL水,加熱至沸騰使瓊脂完全溶解,補足加熱損失的水份,冷卻至85 ℃,倒入測試瓶中至刻度線位置,用濁度儀測定濁度[13]。

1.3 數據處理

實驗采用3次平行實驗,平均值為實驗數據。采用WPS軟件進行平均值、標準偏差和相對標準偏差的計算,用 SPSS Statistics 20.0(IBM)軟件進行顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 國產瓊脂和進口高透明度瓊脂的品質指標分析

由表1可知,通過對不同瓊脂產品質量進行分析,發現國產瓊脂(瓊脂BD18062702、瓊脂BD18041704、瓊脂18040302)透明度小于90%,凝膠強度在1100～1500 g/cm2之間,濁度在50 NTU以上,白度均小于55%。兩種Sigma高透明度瓊脂的透明度顯著高于(P<0.05)國產瓊脂,濁度和凝膠強度顯著低于(P<0.05)國產瓊脂;其中高透明瓊脂SigmaA1296透明度為94.4%,濁度為17 NTU,白度為66.74%,凝膠強度為685.2 g/cm2;高透明度瓊脂SigmaA6066的透明度為92.3%,濁度為21.1 NTU,白度為65.61%,凝膠強度為801.5 g/cm2。通過對比發現,進口高透明度瓊脂的透明度、濁度、白度和凝膠強度分別達到92%、21 NTU、66%、801.5 g/cm2左右,為滿足實際生產需要,國產高透明瓊脂至少需滿足上述指標。

表1的結果同時表明,瓊脂產品的濁度和白度與透明度變化趨勢相同,凝膠強度則與透明度變化相反。相關研究表明,當瓊脂中含有較多親水基團時,瓊脂分子可結合更多的水分子,其形成雙螺旋結構趨勢減弱,而伸展分散的趨勢增加,因此,對光折射減弱,透明度變高,凝膠強度變低[10]。因此,在瓊脂分子中引入親水基團是提高瓊脂透明度的主要方法途徑。

2.2 瓊脂及氯乙酸加入方式對瓊脂凝膠強度和透明度的影響

根據瓊脂加入反應體系的時間及氯乙酸加入模式(速度)不同進行羧甲基化反應,共制備得到4種樣品(表2);它們的凝膠強度沒有顯著差異,但透明度差異顯著(P<0.05),其中D樣品(先溶解試劑、再加入瓊脂粉,氯乙酸等分兩次添加)透明度最高。

表2 瓊脂及氯乙酸加入方式對透明度與凝膠強度的影響Table 2 The effect of agar and chloroacetic acid addition on the transparency and gel strength

在羧甲基化反應過程中,無水Na2SO4主要作為多糖溶解的抑制劑。瓊脂加入反應體系的時間對其溶脹性有顯著影響,從而會影響瓊脂與氯乙酸的反應速度。氯乙酸是羧甲基化的反應試劑,加入過快,瓊脂內外反應不均勻,加入過慢,會被堿中和而失去反應效率,氯乙酸加入速度是影響氯乙酸反應效率的重要因素。

在氯乙酸添加工藝相同的條件下,先配反應溶液后加入瓊脂的制備樣品(樣品D)透明度顯著高于(P<0.05)先加入瓊脂后配反應溶液制備得到的樣品(樣品A)。這是由于樣品瓊脂與無水Na2SO4混合后,再加入水配制反應溶液將導致無水Na2SO4在瓊脂表面形成水合硫酸鈉[14],使瓊脂顆粒與氯乙酸分子隔離,導致反應不均勻或阻斷了反應的進行。在瓊脂加入時間相同的情況下,樣品D的透明度大于樣品C,說明將氯乙酸等分成兩次添加相比于等分成4次添加的反應效率跟高;其原因可能是將氯乙酸分成4次添加,在反應體系中濃度低,容易被堿中和至有效反應濃度值以下[11],導致反應速度慢。

通過以上試驗,確定瓊脂羧甲基化反應配料的工藝為:將無水Na2SO4和NaOH等試劑溶解后,再加入瓊脂粉,并將反應用的氯乙酸等分成兩份間隔10 min添加進入反應體系。

2.3 反應溫度對瓊脂透明度和凝膠強度的影響

反應溫度是影響瓊脂羧甲基化速度的重要因素[14],因此會影響羧甲基反應后瓊脂的透明度。從圖1中可以看出,隨著反應溫度不斷上升,瓊脂透明度逐步增加,凝膠強度不斷降低。這是因為反應溫度的升高使分子運動加劇,增加了氯乙酸分子與瓊脂分子有效碰撞幾率,增加羧甲基化反應速率[15]。此外,在高溫下進行羧甲基化將導致過渡羧甲基化,最終使瓊脂失去凝膠性[16-17]。圖1顯示,當反應溫度大于50 ℃后,雖然羧甲基化后瓊脂透明度還不斷上升,但凝膠強度降至有效凝膠強度值(800 g/cm2)以下,故綜合考慮,采用50 ℃的反應溫度。

圖1 反應溫度對瓊脂凝膠強度、透明度的影響Fig.1 Effects of reaction temperatureon gel strength and transparency

2.4 氯乙酸添加量對瓊脂透明度和凝膠強度的影響

如圖2所示,隨氯乙酸用量不斷增加,瓊脂膠強度逐漸下降,而透明度則逐漸升高。這是由于氯乙酸用量增加使羧甲基程度不斷增高,在瓊脂分子骨架上引入了更多的親水基團,從而導致瓊脂凝膠強度下降、透明度升高[18]。當氯乙酸添加量為 0.38 g/g 時,反應后瓊脂透明度為96.8%,凝膠強度為861.3 g/cm2;氯乙酸添加量為 0.40 g/g時,反應后瓊脂的透明度為 96.7%,凝膠強度為648.2 g/cm2,低于有效凝膠強度值。因此,選擇氯乙酸添加量為 0.38 g/g。

圖2 氯乙酸添加量對凝膠強度和透明度的影響Fig.2 The effect of chloroacetic acid contenton the gel strength and transparency

2.5 反應時間對瓊脂透明度和凝膠強度的影響

相關研究表明,反應時間對羧甲基化反應具有重要影響,反應時間短時,氯乙酸無法與瓊脂分子充分反應,導致羧甲基化反應不能徹底進行[19]。如圖3所示,當反應時間由20 min逐漸增加到50 min時,透明度呈上升趨勢。當反應時間達到50 min時,瓊脂透明度達到最高,凝膠強度為842.4 g/cm2。但隨著反應時間增加到65 min時,瓊脂透明度和凝膠強度同時呈現下降的趨勢,這主要是副反應及羧甲基化反應過度。因此,選取反應時間為50 min。

2.6 清洗體系pH對瓊脂透明度和凝膠強度的影響

pH對瓊脂性質影響很大,它可以直接影響著瓊脂的凝膠強度[20]。如圖4所示,當清洗溶液pH=5時凝膠強度與透明度達到了最大值,當pH<5時,瓊脂的凝膠強度出現了大幅度下降,這與劉汶甲等[21]的研究結果一致,因為pH能夠影響瓊脂分子間氫鍵的形成和瓊脂分子中的鹽橋狀態[22]。當pH>5時,瓊脂的凝膠強度也隨pH升高而降低,因為隨著pH上升,增加了帶負電子硫酸酯基團的斥力,這一結果與Norziah等[23]在研究卡拉膠和瓊脂混合凝膠的質構特性中所得的結論相似。因此,在清洗后用冰醋酸將體系pH調整為5.0。

表3 高透明度瓊脂制備工藝穩定性試驗結果Table 3 The repeatability of process for preparation high transparency agar

圖3 反應時間對凝膠強度和透明度的影響Fig.3 The effect of reaction timeon gel strength and transparency

圖4 pH對凝膠強度和透明度的影響Fig.4 The effect of pH on gel strength and transparency

2.7 不同批次原料瓊脂對高透明度瓊脂凝膠強度、透明的和濁度的影響

對三個不同批次的瓊脂原料進行高透明度瓊脂制備實驗,氯乙酸添加量0.38 g/g,反應溫度為50 ℃,反應時間為50 min,清洗后調節pH=5.0后干燥粉碎,各樣品品質測定結果如表3所示,計算后得到三個不同批次的樣品其凝膠強度均值為1095.2 g/cm2,相對標準偏差為1.8%;透明度均值為96.5%,相對標準偏差為0.6%;濁度均值為8.9 NTU,相對標準偏差為1.1%。以上結果說明優化的工藝制備得到高透明度瓊脂相關指標具有良好的穩定性且與進口高透明度瓊脂指標一致。

3 結論

國產瓊脂與進口高透明度瓊脂產品的主要質量差異是:國產瓊脂的透明度與白度低,濁度高;采用羧甲基化工藝提高瓊脂透明度,優化的工藝條件為:氯乙酸添加量0.38 g/g,反應溫度50 ℃,反應時間50 min,調節pH=5.0后清洗干燥。用此工藝制備高透明度瓊脂,透明度為96.5%±0.6%,凝膠強度為(1095.2±19.8) g/cm2,濁度為(8.9±0.1) NTU,結果穩定,且指標優于進口高透明瓊脂。因此,本項目建立了穩定生產高透明度瓊脂的工藝,為提高國產瓊脂的價值提供了技術參考。