仿刺參腸道神經定位初步研究*

侯媛媛， 陳慕雁

(海水養殖教育部重點實驗室(中國海洋大學)， 山東 青島 266003)

棘皮動物、脊索動物類和半索亞門類動物共同構成了后口動物，這使得棘皮動物成為研究脊索動物類起源的重要節點。棘皮動物成體具有獨特五重對稱結構，其神經系統一般包括一個圍口神經環和相連的5條徑向神經線，這5條徑向神經線穿梭在身體的縱肌和環肌之間。大多數棘皮動物(除了海百合類)的神經系統都被認為包含兩個獨立的部分:外神經系統和深層神經系統，它們被基底膜所分隔[1-2]，在神經系統進化的研究中占據了重要的地位。然而由于棘皮動物神經系統結構的獨特性及難以定位，使得其中央神經系統研究遠遠落后于其他動物。

海參綱(Holothuroidea)是棘皮動物進化中出現最晚的一個綱，和海膽綱(Echinoidea)的親緣關系最近[2]。仿刺參(Apostichopusjaponicus)作為海參綱的代表種，是我國重要的海產經濟物種, 具有極高的食用與醫用價值，主要分布于我國遼寧、河北、山東沿岸淺海[3]。目前仿刺參以其獨特的進化地位和特殊的生理特性(再生，自溶，夏眠)日益受到關注[4-7]，然而關于仿刺參的神經定位的研究國內外尚鮮有報道，有限的研究主要集中在少數幾種神經肽的發掘和組織定位[1,8-9]。本研究中，我們利用組織學技術結合棘皮動物神經的特異性抗體1E11[10]，初步探究刺參腸道中神經的定位。已有研究表明，刺參腸道具有很強的再生能力以及長期夏眠萎縮后的快速修復能力[11-12]，然而相關研究都主要局限于傳統的組織學描述，并沒有對此過程中起到關鍵作用的神經定位進行分析，我們期望通過腸道神經定位的基礎研究，為刺參特殊生理機制以及刺參神經生物學的研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和暫養條件

仿刺參成體體重(100±10) g，取自山東省青島市膠南刺參養殖場。實驗前，置于實驗室循環水水槽內暫養7 d，水溫15～18 ℃。定量投喂人工配合飼料 (海泥和鼠尾藻(Sargassumthunbergii)按比例混合而成)，以確保刺參盡快適應環境。

1.2 樣品固定及制備

取健康狀況良好不吐腸的仿刺參9～10頭，停食72 h，待其排空消化道內食物殘渣后，將其放入盛有1 L新鮮海水配置的0.3 mol/L硫酸鎂溶液中。待仿刺參運動減弱，觸手、管足伸展且不再收縮為止。取出仿刺參個體，進行解剖，取出腸道樣品，大小尺度約1～2 mm2,蒸餾水對其進行沖洗。

HE，米利根染色樣品制備：波恩液固定12～24 h；樣品經不同濃度梯度酒精脫水(70%、80%、95%、95%、100%和100%，每步30 min)；完全脫水后組織轉入100%酒精∶二甲苯=1∶1的混合液中30 min，在二甲苯中透明20 s；透明后樣品依次在二甲苯∶石蠟=1∶1，石蠟中分別浸泡25 min，二次浸泡在純石蠟中50 min包埋，冷卻后修片，切片厚度調整為7 μm。

1E11免疫組化樣品制備：樣品在pH=7.4的4%多聚甲醛/PBS中短時間固定最多10 min，固定之后，樣品用PBS(3×5 min)洗滌，然后通過在一系列上升濃度蔗糖溶液(10%，20%和30%，每步3 h，室溫)中撫育被凝凍保護。樣品用OCT包埋后，立刻放入-80 ℃冰箱中。用萊卡CM3050 S 低溫切片12 μm并在多聚賴氨酸載玻片上收集，保存在-20 ℃。

1.3 切片染色

1.3.1 HE染色 切片用蘇木精和伊紅分別染色后，擦去切片周圍多余二甲苯，迅速在切片上滴加適量中性樹膠，蓋上載玻片，注意不要有氣泡，玻片晾干后用Nikon E 600顯微鏡觀察切片并拍照。

1.3.2 米利根染色 切片用二甲苯澄清5 min，在純酒精中水合5 min，切片用如下方法染色：溶液A(2.25 g重鉻酸鉀、2.25 mL濃鹽酸加入含25 mL的95%酒精和75 mL的蒸餾水中)中5 min，蒸餾水洗滌2 min;溶液B(0.1 g品紅加入100 mL蒸餾水中)中5 min，蒸餾水快洗30 s;溶液C(1 g磷鉬酸加入100 mL蒸餾水中)中1 min，蒸餾水洗2 min;溶液D(2 g的Orange G和1 g的磷鉬酸分別加入100 mL蒸餾水中)中染色5 min，蒸餾水水洗2 min;溶液E(1 mL冰醋酸加入100 mL蒸餾水中)、F(在100 mL蒸餾水中加入Fast green FCF 0.1 g，冰醋酸0.2 mL)，E中分別染色2、5和3 min。這個過程完成之后，切片在純酒精中脫水5 min，二甲苯中澄清5 min，迅速在切片中央滴加一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片，用中性樹膠蓋片。染色好的切片用尼康Eclipse E600顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 免疫組化染色 將樣品玻片浸入修復緩沖液(pH=6.0的緩沖液：0.1 mol/L的A液(檸檬酸鈉 Na3C6H5O7·2H2O 29.4g 加蒸餾水至1 L)16.2 mL，0.1 mol/L的B液(檸檬酸C6H5O7·H2O 21.0 g 加蒸餾水至1 L)3.8 mL，加蒸餾水稀釋至200 mL進行抗原熱修復，高壓滅菌鍋內120 ℃，7 min，自然冷卻至室溫后將玻片從修復緩沖液中取出，將載玻片四周擦干凈，用免疫組化防水筆將組織圈起；在圈起的組織上滴加1%H2O2-PBS(1 μL H2O2，1 mL PBS)，濕盒內室溫孵育20 min消除內源性酶，PBST漂洗5 min×3；漂洗后，組織上滴加5%羊血清/PBST溶液，在濕盒內37 ℃封閉背景2 h，甩去多余液體，不洗。

實驗組樣品滴加1∶3(5%羊血清:PBST)稀釋的鼠源一抗1E11(加拿大維多利亞大學Dr. Robert D. Burke[13]提供)，對照組樣品滴加1∶10(5%羊血清:PBST)稀釋的一抗1E11，玻片濕盒內4℃過夜；次日PBST漂洗3次，1次5 min；漂洗過后，實驗組、對照組組織上滴加稀釋后的羊抗鼠辣根過氧化酶二抗(藥明康德AB-ASS1021)(二抗：2%羊血清/PBST 1∶500稀釋)，將其放入濕盒內37 ℃孵育3 h，隨后PBST漂洗3次，一次5 min。

用增強型DAB顯色緩沖液發色，直到能觀察到染色，迅速對切片用PBS，滅菌水順序洗滌，然后滴加Hydromount，蓋上蓋玻片，用Olympus BX51顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與討論

2.1 腸道組織學結構及神經定位

仿刺參的腸道根據其延伸的方向和附著的位置可分為前腸、中腸和后腸，前腸附著于背腸系膜，位于食道、胃下方，腸道向下延伸快到泄殖腔處為第一下降部即前腸，然后其轉向左邊往上延伸為上升部即中腸，中腸附著于側腸系膜，至咽部下方沿腹中線向下延伸至肛門為第二下降部即后腸，后腸附著于腹腸系膜上(見圖1a)。

仿刺參腸壁由外向內分為4層：(1)外層的體腔上皮層即漿膜層；(2)肌肉層，其內層為縱肌層，外層為環肌層；(3)內部結締組織層即黏膜下層；(4)腸腔上皮層即黏膜層。仿刺參中腸上皮皺襞不規則，常形成高、窄的褶皺，且方向較單一，有的褶皺還有分支(見圖1b)，而后腸皺襞與中腸相比較低，無橫向皺襞，縱向皺襞較規則且高低不一，其黏膜下層疏松結締組織與中腸相比較厚，黏膜層向疏松結締組織凹陷，形成近似長方形或三角形的褶皺，其黏膜上皮多由單層柱狀細胞構成，且細胞排列整齊(見圖1c)，圖1d中可看出后腸黏膜上皮中有少量橢圓形空泡狀的杯狀細胞，HE染色為無色，且肌肉層也呈現外環內縱排列，環形肌纖維比縱肌纖維更明顯，其外膜由復層上皮細胞和結締組織構成。

仿刺參腸道內壁有橫向、縱向褶皺，中腸常形成高而窄且方向單一的褶皺，后腸多為較規則的縱向褶皺，后腸黏膜層多為單層或復層的黏膜上皮與崔龍波[14]的結論一致。同時，仿刺參的前腸和中腸因細胞內含較多的核酸，且呈現非特異性酯酶和蛋白酶脂酶活性而起主要的消化吸收作用[14]，而中腸內壁與后腸相比，其內壁大量高而窄的褶皺，在結構上擴大了吸收面積，體現了結構功能相統一的原理。

米利根染色結果表明：核、肌肉染為紅色，膠原蛋白(纖維)染為藍色，神經系統染為淺紫色。從圖2b中可看出腸壁的縱向肌肉染為紅色，整條縱肌偏紫，表明肌肉細胞中神經纖維的存在；腸腔上皮層中神經成分較多(顏色深)，其次是體腔上皮層(黑色箭頭)，這與García-Arrarás[15]在海參(Holothuriaglaberrima)中的研究結果類似，他們在H.glaberrima腸壁中發現，從外向內的體腔上皮層、肌肉層、內部結締組織層和內里的腸腔上皮層中均含有神經成分。

(a. 刺參腸道解剖圖；b. 腸道中腸橫切HE染色；c. 腸道后腸橫切HE染色；d. 圖c局部放大圖。a. The intestinal tract ofA.japonicus; b. Transverse section of the mid-intestine with HE staining; c. Transverse section of the posterior intestine with HE staining;; d. Local magnification of figure c. il：腸腔；sce：單層柱狀上皮；ct：結締組織；g：杯狀細胞；lm：縱向肌肉；cm：環形肌肉; ai: 前腸; mi: 中腸; pi: 后腸。il: Intestine lumen; sce:Simplecolumnarepithelium; ct: Connective tissue; g: Goblet cells; lm: Longitudinal muscle; cm: Circular muscle; ai: Anterior intestine; mi: Mid-intestine; pi: Posterior intestine.)

圖1 仿刺參腸道的HE染色圖

Fig.1 The HE staining images of intestine ofA.japonicus

(a. 后腸橫切米利根染色；b. 圖a為局部放大圖。a.Transverse section of the posterior intestine with Milligan staining; b. Local magnification of figure a.il：腸腔； ct：結締組織；lm：縱向肌肉；ce：體腔上皮；ie：腸腔上皮。il: Intestine lumen; ct: Connective tissue; lm: Longitudinal muscle; ce: Coelomic epithelium layer; ie: Intestine epithelium layer.)

圖2 仿刺參腸道的米利根染色圖

Fig.2 The Milligan staining images of intestine ofA.japonicus

相比HE染色法顯示組織細胞的基本結構而言，米利根染色法更適用于觀察肌肉、膠原、神經系統的分布，其能使組織中的各主要成分以不同顏色顯現出來，色彩對比鮮明，更易觀察染色結果[16]。Inoue[1]、Tamori[9]等分別用米利根染色來研究仿刺參徑向神經線的組織學結構，為后續研究神經肽NG1WYamide和stichopin的分布及功能驗證提供理論基礎；而Inoue[17]等利用米利根染色觀察了仿刺參體壁整體的神經纖維和分支分布，為仿刺參體壁縱向肌肉受內神經支配結論的提出奠定了基礎。

2.2 腸道中免疫組化神經定位

1E11是突觸結合蛋白B的神經元特異性抗體[13,18]。Burke等[13]的研究表明球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)徑向神經提取物中1E11對突觸結合蛋白B的特異性結合。目前已經在許多棘皮動物的幼體和部分成體中驗證了1E11的神經元特異性結合特性，這使得1E11單克隆抗體成為棘皮動物神經的公認標記物[9-10,18-19]。本研究同樣發現1E11是仿刺參成體神經組織的良好標識物。研究中我們利用1E11抗體對仿刺參腸道陰性對照組(1∶10稀釋)、實驗組(1∶3稀釋)神經組織進行化學定位，采用DAB染色，最終呈現出的棕黃色顆粒為陽性雜交位點。研究結果表明，1E11在陰性對照組中的肌肉層中有表達，而在最外層的體腔上皮層和肌肉層下方的內部結締組織中鮮有活性反應(見圖3a)；實驗組中1E11 在腸道組織的陽性反應廣泛而強烈，體腔上皮層、肌肉層、內部結締組織層均有染色，且肌肉層中染色最深(見圖3b)。

仿刺參神經系統不同于脊椎動物，沒有腦部結構，是由圍口神經環和分散輻射對稱的5條徑向神經線整合在一起，形成網狀結構。盡管仿刺參的神經系統較為簡單且缺乏特化的感受器，但仿刺參在正常情況下的復雜且協調的運動及其特殊的生理現象[5,7,20]顯示了其神經系統網絡的高度協調性[2]。

Anderson等[21]研究表明，在與海參親緣關系很近的海星(Leptasteriaspusilla)臂的再生依賴于神經的再生。而在海參綱動物中，腸道是其吐臟再生的首個器官[20]，García-Arrarás[15]用單克隆抗體和標記技術在海參腸道再生完成之前觀察到了神經成分，與我們的研究結果一致；此外，Díaz-Miranda等[22]在海參中第一次分離純化了海參綱的肽類物質GFSKLYFamide和SGYSVLYFamide，并用放射免疫分析方法檢測到其分布于腸道的神經細胞和纖維中，其中GFSKLYFamide會導致海參腸道的肌肉張力松弛[23]。這同樣支持了我們利用1E11免疫組化染色結果中肌肉染色強陽性結果。除再生外，刺參在夏眠這一特殊生理習性期間，最顯著的變化是腸道組織的整體退化，變細變短[24]，在夏眠解除后，其腸道組織迅速在短時間內恢復正常的尺寸和功能。Inoue等[1]研究表明神經肽NGIWYamide在調節仿刺參腸肌活性方面有一定的作用。結合本文的研究結果，推測仿刺參腸道內存在可控制夏眠期間腸道肌肉的神經肽，而其通過神經系統起作用。

(a. 腸道1E11免疫組織化學反應陰性對照(1∶10稀釋)；b. 腸道1E11免疫組織化學反應，箭頭呈強陽性反應(1∶3稀釋)。a. Intestinal 1E11 immunohistochemical reaction in negative control(1∶10 dilution); b. Intestinal 1E11 immunohistochemical reaction, the arrow shows the strong positive reaction (1∶3 dilution).I：腸腔；M：肌肉層；ct：相連組織； ce：體腔上皮。I. Intestine lumen; M. Muscle layer; ct: Connective tissue; ce: Coelomic epithelium layer.)

圖3 仿刺參腸道橫切1E11免疫組化染色

Fig.3 The Immunohistochemistry 1E11 staining images of the cross-section intestine ofA.japonicus

3 結語

本研究利用HE、米利根染色及免疫組化技術對仿刺參腸道的組織學結構及神經分布進行了觀察、分析和探討。研究發現，仿刺參中腸內壁常形成高且窄的褶皺，這一擴大吸收面積的結構特點與其主要起消化吸收作用的功能一致，通過米利根染色發現仿刺參腸壁的縱向肌肉、腸腔上皮層和體腔上皮層均存在神經成分，免疫組化研究結果顯示1E11在腸道的每個組織層均有表達，且肌肉層中分布最多。本研究中觀察到的仿刺參腸道內存在的神經組織是神經系統的一部分，我們推測其在調控肌肉神經支配上起作用，參與腸道的再生過程及長期夏眠萎縮后的腸道快速修復過程，關于這一點尚待深入研究。