奶渣蛋白肽的分離純化及其抗氧化活性研究

魏光強，黃琳茹，林詩洋，黃艾祥

（云南農業大學食品科學技術學院，昆明650201）

0 引 言

奶渣（Milk residue），是藏區牧民提取酥油后制成的副產品，含有豐富的蛋白質[1]，是易于保存的優質蛋白來源。貫筋藤凝乳酶為一種復合蛋白酶能降解乳中酪蛋白（CN）產生小分子肽，可用于酶解奶渣制備蛋白肽。自由基具有強氧化性，可損害機體的組織和細胞[2-3]，引起衰老和慢性疾病，抗氧化肽安全、易吸收，所以開發天然抗氧化劑成為營養學研究的熱點[4]。目前，多肽分離純化的方法主要有超濾法[5]、凝膠色譜層析[6]、離子交換層析、吸附層析及高效液相色譜等。

奶渣作為副產品，產量高、價格低廉，除直接食用外，緊局限于干酪素的生產[7-8]，本研究采用貫筋藤蛋白酶酶解制備奶渣蛋白肽，通過超濾制備分子量10 ku以下的蛋白肽樣品，采用Q-Sepharose FF層析柱進一步分離純化獲得具有較高抗氧化活性的奶渣蛋白肽組。本研究為進一步深入研究和開發天然抗氧化蛋白肽以及奶渣制品奠定基礎。

1 實驗

1.1 材料

原料為貫筋藤凝乳酶（由實驗室自制）[9-10]和奶渣。

試劑：2,2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH），質量分數為30%過氧化氫（H2O2），2,2-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（ABTS），谷胱甘肽（GSH）標準品，HPLC≥98%。

1.2 儀器與設備

Q-Sepharose FF（Q-瓊脂糖凝膠FF），DHG-9070A真空冷凍干燥機，SBS-100數控計滴自動部分收集器，URA14M 0018分光光度計，RE-52AA旋轉蒸發儀，TGL20M高速冷凍離心機，HL-2恒流泵，磁力加熱攪拌器。

1.3 方法

1.3.1 奶渣蛋白肽的制備

奶渣→超微粉碎→加水溶解→超聲提取→振蕩水浴酶解→離心→取上清液→冷凍干燥→奶渣蛋白肽。

1.3.2 填料Q-Sepharose FF的處理

將溶脹在體積分數為20%乙醇中的強陰離子填料Q-Sepharose FF攪勻，按實驗所需取出相應的量，靜置后，用pH=8.0濃度為20 mmol/L的Tris-HCl起始緩沖液置換體積分數20%的乙醇溶液3～5次，最終使緩沖液與膠體的體積比為1∶3。

1.3.3 奶渣蛋白肽的Q-Sepharose FF柱層析分離

將處理好的Q-Sepharose FF裝入色譜柱中，接恒流泵，用3倍體積、一定濃度的NaCl溶液平衡色譜柱，待設置的流速穩定后，加入一定濃度的過0.45μm濾膜奶渣蛋白肽，連接好自動部分收集器，收集色譜峰，測定220 nm下的吸光值，繪制色譜峰。

通過單因素實驗優化Q-Sepharose FF色譜柱分離的洗脫液（NaCl）濃度、流速、上樣濃度，以獲得最優分離純化工藝。

（1）NaCl洗脫濃度的篩選。分別使用濃度為0，0.05 mol/L和0.10 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，繪制特征吸收峰峰圖，根據洗脫峰型確定最佳洗脫液濃度。

（2）洗脫流速的篩選。分別在0.5，1.0 mL/min和2.0 mL/min流速下進行洗脫，記錄數據，繪制特征吸收峰峰圖，根據洗脫峰型確定最佳洗脫流速。

（3）上樣濃度的篩選。分別對Q-Sepharose FF柱加載質量濃度10，20 mg/mL和40 mg/mL奶渣蛋白肽樣液，使用最佳洗脫液鹽質量濃度和流速進行洗脫，繪制特征吸收峰峰圖，根據洗脫峰型確定最佳上樣質量濃度。

1.3.4 抗氧化活性測定

（1）ABTS自由基清除率測定[11]。分別吸取不同樣品的奶渣蛋白肽溶液500μL，加734 nm處吸光度為0.7～0.8的ABTS·+稀釋工作液（濃度為5 mol/L，p H=7.4的PBS稀釋）3.8 mL，室溫下反應6 min，于734 nm測定吸光值，以GSH作為對照。

計算采用如下公式：

ABTS·自由基清除率=[(s-sb)/(c-cb)]×100%，

式中：s為ABTS·自由基清除能力吸光度；sb為樣品干擾實驗吸光度（調零）；c為ABTS·工作液吸光度；c b為蒸餾水的吸光度（實驗前調零）。

（2）DPPH自由基清除率測定[12]。在200μL粗提液中加入2 mL的DPPH甲醇溶液，漩渦振搖后，在室溫下暗處放置10 min，517 nm處測定液體的吸光度，蒸餾水作為空白對照，且代替DPPH溶液調零，然后測定其吸光值（測定波長為517 nm）,以GSH作為對照。其中，計算DPPH自由基清除率公式如下：

DPPH·清除率=[(s-sb)/(c-cb)]×100%，

式中：s為DPPH·自由基清除能力吸光度；sb為樣品干擾試驗吸光度（調零）；c為DPPH甲醇溶液吸光度；cb為蒸餾水吸光度（調零）。

（3）還原能力測定[13]。取2 mL樣品溶液加入2.5 mL，p H=6.6濃度為0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和質量分數為1%鐵氰化鉀2.5 mL，混合溶液在50℃下恒溫20 min，再加2.5 mL 10%三氯乙酸，離心取上層清液1 mL純水2.5 mL和質量分數為1%的FeCl3溶液0.5 mL，在700 nm處測定吸光值，以去離子水代替樣品溶液作為空白實驗，以GSH作為對照。

（4）羥自由基清除率的測定[14-15]。取2 mL樣品與1.865 mmol/L的1,10-菲咯林溶液1 mL混勻，并加入1 mL濃度為1.865 mol/L的FeSO4·7H2O溶液，再加入1 mL質量分數為0.03%的H2O2開始反應，37℃下水浴60 min，反應混合物在536 nm測定吸光度，以GSH作為對照。

自由基清除率按下列公式計算:

式中：As為對照的吸光度；An為樣品的吸光度；Ab為不加抗氧化劑的吸光度。

（5）抗氧化活性IC50值的測定。將樣品配制成1，2，3，4，5 mg/mL不同質量濃度實驗點（≥5），分別測定其ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率、還原能力、羥自由基清除率。以樣品濃度為橫坐標，測定值為縱坐標，繪制擬合曲線，從曲線中計算出IC50值。

1.4 數據處理與統計分析

采用Origin 2017和Excel 2016對實驗數據進行整理，利用spss24對數據進行方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 奶渣蛋白肽的Q-Sepharose FF柱層析分離

2.1.1 最佳NaCl洗脫濃度

離子交換色譜是通過色譜介質與溶質之間的靜電作用差異實現分離的一種手段，因而提高流動相的離子強度可抑制介質與溶質之間的靜電作用從而使溶質與介質發生解吸。NaCl洗脫液濃度對奶渣蛋白肽的分離影響如圖1所示。

圖1 Q-Sepharose FF洗脫液濃度分離圖譜

由圖1中可看出在NaCl洗脫液濃度為0.10 mol/L時，在220 nm處有3個特征吸收峰，多次試驗，均能分出3個峰，且峰型較好，出峰面積大。用濃度為0.05 mol/L的NaCl溶液洗脫時，在220 nm處也有3個特征吸收峰，但是第二個和第三個特征吸收峰很??；在用純水進行洗脫分離時，在220 nm處僅有兩個特征吸收峰，出峰不完整。純水和濃度0.05 mol/L的NaCl都未達到有效分離，可能的原因是NaCl濃度過低，靜電作用低，未能把多肽洗脫下來。因此，選用濃度為0.10 mol/L的NaCl溶液為最佳洗脫濃度。

2.1.2 最佳洗脫流速

NaCl洗脫流速對奶渣蛋白肽的分離影響如圖2所示。

圖2 Q-SepharoseFF洗脫流速分離圖譜

由圖2可看出，隨著洗脫流速的增加，特征吸收峰的出峰時間提前。在流速為1 mL/min時，第一個特征吸收峰明顯降低，第二和第三個吸收峰未完全分離，有相連現象；在流速為0.5 mL/min時，第二個吸收峰譜峰較寬，峰面積較小，洗脫率較低，這可能是洗脫流速較低，柱壓也較低，出現樣品擴散、譜峰變寬，洗脫效率降低。在2.0 mL/min的條件下，分離出來的3個特征吸收峰，峰型和分離效果良好。綜上所述，選擇最佳洗脫流速為2.0 mL/min。

2.1.3 最佳上樣濃度

上樣濃度對奶渣蛋白肽的分離影響如圖3所示。

圖3 Q-Sepharose FF上樣濃度分離圖譜

由圖3中可看出，各濃度的奶渣蛋白肽3個特征吸收峰的分離效果較好，隨著濃度的增加，各特征吸收峰均呈現上升趨勢。當質量濃度為10 mg/mL時，第一個特征吸收峰較好，但第二和第三特征吸收峰的洗脫率較低，這是因為葡聚糖凝膠分離過程中的離子交換、離子排斥、離子包含、疏水作用和吸附作用等二級非體積排阻效應使原本極其微弱的峰消失，且若上樣量過少，分離提純得到的各組分就相對較少、濃度較低，造成洗脫液的浪費和實驗效率低下。當質量濃度為20 mg/mL時，呈現良好的峰型和分離效果，但第二個和第三個特征峰的洗脫率稍低；當質量濃度為40 mg/mL時，各個峰型和分離效果都較好，綜合考慮，選擇最佳上樣質量濃度為40 mg/mL。

2.1.4 奶渣蛋白肽分離純化最佳工藝條件

根據單因素實驗確定Q-Sepharose FF柱層析最佳洗脫工藝為：洗脫液濃度0.1 mol/L，上樣質量濃度40 mg/mL，洗脫流速2.0 mL/min，在此條件下的峰分離度較好，峰型對稱，如圖4所示。圖4中，第一個峰為峰A，第二個為峰B，第三個為峰C。在最佳分離條件下大量收集組分A，B，C；透析48 h后，濃縮冷凍干燥，在-80℃下保存備用。

圖4 奶渣蛋白肽的分離純化圖譜

2.2 奶渣蛋白肽抗氧化活性

2.2.1 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基為穩定的有機自由基，蛋白肽抗氧化能力越強，其提供電子的能力也就越強，與該有機自由基反應量越大，反應速率也越快，通過測定反應液吸光度的變化，能夠反映出樣品抗氧化能力的大小。奶渣蛋白肽的ABTS自由基清除率如圖5所示。

圖5 ABTS自由基清除能力

由圖5可以看出，奶渣蛋白肽分離各組分隨著濃度的提高，ABTS自由基清除活性顯著增強，奶渣蛋白肽組分A的ABTS自由基的清除能力最強，在質量濃度是5 mg/mL時，ABTS自由基的清除率為56.12%，而組分B和C的ABTS自由基的清除率相對較弱，分別為27.12%和33.80%。4個組分的ABTS自由基清除能力IC50如表1所示，組分A的IC50最低為4.379 mg/mL。以上結果表明它們對ABTS自由基清除能力為：組分A＞組分C＞組分B。此研究與杜昕等[16]通過超濾、凝膠層析法得到分子量小于5 ku，具有較高ABTS自由基清除活性的牦牛血抗氧化肽結果一致。

表1 4個組分的ABTS自由基清除能力IC50

2.2.2 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基是人工合成的能穩定存在的自由基，是反映物質的抗氧化能力的一個重要標準。奶渣蛋白肽的DPPH自由基清除率如圖6所示。

圖6 DPPH自由基清除能力

由圖6可以看出，奶渣蛋白肽分離得到的各組分均具有清除DPPH自由基的能力，且DPPH自由基清除活性表現出顯著的濃度依賴關系。在質量濃度為5 mg/mL時，奶渣蛋白肽組分A，B和C對DPPH自由基清除率分別為58.6%，24.1%和30.2%；組分A的DPPH自由基清除率高于高維東等[17]通過Sephadex G-15分離得到的牦牛酪蛋白DPPH自由基清除率47.9%，說明奶渣蛋白肽具有一定的DPPH自由基清除活性，可能是分離組分A中含有大量的氨基酸基團，能傳遞氫離子或電子給DPPH自由基。4個組分的DPPH自由基清除能力IC50如表2所示，組分A的IC50最低為3.921 mg/mL。以上結果表明它們對DPPH自由基清除能力：組分A＞組分C＞組分B。

表2 4個組分的DPPH自由基清除能力IC 50

2.2.3 還原能力測定

還原力的測定通常被用來評價抗氧化劑提供電子或氫的能力，奶渣蛋白肽的還原能力如圖7所示。

圖7 奶渣蛋白肽的還原能力

由圖7可以看出，奶渣蛋白肽各組分都有一定的還原能力。在奶渣蛋白肽各組分質量濃度為1～5 mg/mL時，隨著樣品濃度的增加，還原力也顯著增大，即表現出還原力與其濃度成量效關系。其中組分A的還原能力最強，在質量濃度為5 mg/mL時，其還原能力為1.308，組分B和C的還原能力較弱分別為0.627和0.974。4個組分的還原能力IC50如表3所示，組分A的IC50最低為1.196。以上結果表明它們的還原能力：組分A＞組分C＞組分B。

表3 4個組分的還原能力IC50

2.2.4 羥自由基清除率測定

奶渣蛋白肽的羥自由基清除率如圖8所示。

圖8 羥自由基清除能力

由圖8可以看出，奶渣蛋白肽各組分·OH除率與奶渣蛋白肽的濃度呈明顯的正相關，與奶渣蛋白肽分離組分B和C比較，奶渣蛋白肽組分A的·OH清除能力更強。在質量濃度為5.0 mg/mL時，奶渣蛋白肽組分A、B和C對·OH清除率分別為49.73%，23.59%和28.34%。4個組分的還原能力IC50如表4所示，組分A的IC50最低為5.076 mg/mL，高于高維東等[17]通過Sephadex G-15分離得到的牦牛酪蛋白組分Ⅱ的·OH清除率IC50值1.4 mg/mL，說明奶渣生產過程中的強酸強堿環境對奶渣蛋白肽的抗氧化活性有一定的損傷。以上結果表明它們的·OH清除能力為：組分A＞組分C＞組分B。

表4 4個組分的羥自由基清除能力IC50

3 結 論

奶渣蛋白肽Q-Sepharose FF凝膠層析分離的最優工藝條件為：洗脫液濃度0.1mol/L，上樣量40 mg/mL，洗脫流速2.0 mL/min，共分離出A，B，C三個組分，其中組分A的抗氧化能力最強，對ABTS自由基清除率的IC50為4.379 mg/mL，DPPH自由基的清除率IC50為3.921 mg/mL，還原能力IC50為1.196，羥自由基清除率IC50為5.076 mg/mL。表明奶渣蛋白肽具有一定的抗氧化活性，為進一步深入研究和開發具有高抗氧化活性的奶渣蛋白肽奠定基礎。