丹參素-絲裂霉素C攣藥的制備及體外釋放研究·

陳卓 譚李玉 尤靜 張蕾

摘 ?????要： 為了降低高毒性藥物絲裂霉素C（MMC）在治療翼狀胬肉時的副作用，多靶點聯合抑制翼狀胬肉成纖維細胞，將其與具備抗成纖維細胞活性及血管保護作用的無毒藥物丹參素（DSS）化學偶聯為攣藥MMC-DSS。體外釋放研究表明，MMC-DSS可以積聚在眼表后逐漸釋放MMC與丹參素以產生活性。從而獲得了一種在翼狀胬肉治療中結膜血管副作用更低，且能夠多靶點產生藥效的全新攣藥。

關 ?鍵 ?詞：丹參素;絲裂霉素C;攣藥;翼狀胬肉

中圖分類號：TQ 463 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）03-0459-03

Abstract： In order to reduce the side effects of Mitomycin C in the treatment of pterygium， twindrug MMC-DSS was prepared by chemical coupling of Danshensu and MMC. Its release in vitro was studied. The results showed that the twindrug MMC-DSS could amass in ocular surface and then release the MMC and the Danshensu to generate multi-target activity. A reduction of side-effects of MMC in the treatment of pterygium was achieved by this new twindrug through its multi-target therapy.

Key words： Danshensu; Mitomycin C ; Twindrug; Pterygium

翼狀胬肉是一種當結膜持續性受到紫外線、風沙、霧霾等外界刺激后，在瞼裂部球結膜引起成纖維細胞增殖導致的贅生性病變。翼狀胬肉是高日照地區，如陜西、山西、內蒙、寧夏、青海、新疆、西藏等地區常見的眼科疾病，長期困擾著這些地區的群眾尤其是長期戶外作業者。翼狀胬肉浸潤角膜會導致散光，炎癥，甚至失明[1]。翼狀胬肉目前在眼科臨床主要依靠手術切除[2]，切除后眼表殘存的成纖維細胞具有很強的腫瘤樣特征，如果術中、術后不加干預，殘存的成纖維細胞會快速增殖，導致強復發[3]。因此，現行的臨床治療指南要求在手術切除翼狀胬肉組織以后在結膜施用絲裂霉素C（Mitomycin C ， MMC）來抑制成纖維細胞的生長。但是，MMC的毒性較大，使用后會導致晶狀體、玻璃體及視網膜等受損[4]。尋找低毒性的成纖維細胞抑制藥物是目前翼狀胬肉治療中的重要任務。

丹參素（Danshensu，DSS）是中藥丹參（Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhiza）中的活性成分，在臨床上主要用于保護心、腦等臟器免收缺氧損傷[5]。近年來的研究發現，丹參素還具有抗成纖維細胞增生的作用[6]，其可以抑制肝星狀細胞的增生，從而預防免疫性肝纖維化[7]，可以抑制人腎成纖維細胞的增生并誘導其凋亡[8];在眼科的研究也發現，丹參素可以有效抑制眼成纖維細胞的增殖，并誘導其凋亡，從而對眼部成纖維細胞增殖性疾病表現出良好的治療作用[9]。

本研究將絲裂霉素C與丹參素通過化學合成的方法制備為攣藥MMC-DSS（圖1），此攣藥有望具有以下三個優點：第一，使藥物在靶部位同時釋放絲裂霉素C及丹參素，兩者抑制成纖維細胞增殖的機理不同[4，9]，可以產生雙靶點協同作用，提高了藥效;第二，丹參素的分子結構上除偶聯反應使用的羧基外，還具有三個羥基，可以與水分子形成氫鍵，從而可以提高MMC的水溶性，使之難以透過角膜[10]，積累在親水的結膜組織液中，隨時間慢慢在結膜組織中發生水解反應，反應產物為一分子絲裂霉素C與一分子丹參素，這樣既達到了靶向與翼狀胬肉組織的作用，又達到了隨水解反應緩釋的效果;第三，丹參素對正常眼組織細胞的毒性遠低于抗癌藥物MMC，且具有血管保護作用[11]，兩者聯用可以在獲得同等藥效的前提下降低藥物的副作用。本文對所獲得的攣藥分子MMC-DSS還進行了In Vitro drug release研究，發現其在人工淚液模擬的眼表環境下能夠呈零級緩慢釋放，這驗證了我們對攣藥功能的設計，有望獲得一種新穎的翼狀胬肉治療藥物（圖1）。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?原料與試劑

絲裂霉素C純度為98+% （MCE中國）;丹參素鈉純度為98+% （ark pharm）;N-甲基嗎啉為分析純（上海阿拉丁生化科技）;N-羥基琥珀酰亞胺為分析純（安耐吉化學）;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二酰亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）為分析純（安耐吉化學）;其他常見有機溶劑、試劑均為分析純，必要時干燥。

1.1.2 ?儀器

微量厚壁反應瓶為V131003型（北京欣維爾玻璃儀器有限公司）;高效液相色譜儀為1260型（美國安捷倫公司）;磁力攪拌低溫槽為PSL-1810型（日本東京理化株式會社）。

1.2 ?MMC-DSS的制備研究

1.2.1 ?β-（3，4-二羥基苯基）乳酸N-羥基丁二酰亞胺酯（丹參素-NHS，化合物1）的制備向3 mL微量厚壁反應瓶中加入丹參素鈉10.3 mg（46.8 μmol），EDC鹽酸鹽28.9 mg（151.3μmol）， N-羥基丁二酰亞胺5.8 mg（50.4 μmol），使用微量注射器加入100 μLN-甲基嗎啉，加入0.7 mL DMSO后，在攪拌下溶解，N2保護下室溫反應24h，將反應液倒入5 mL 2 N 鹽酸與10 mL二氯甲烷的混合液中，充分震蕩后分液，二氯甲烷層干燥后蒸干，得褐色油狀物 5.16 mg，收率37.4%， 因極不穩定，不經檢測直接用于下一步反應，投料前充N2保存于-20 ℃。

1.2.2 β-（3，4-二羥基苯基）乳酸酰絲裂霉素C（MMC-DSS）的制備

向3 mL微量厚壁反應瓶中加入β-（3，4-二羥基苯基）乳酸N-羥基丁二酰亞胺酯（丹參素-NHS，化合物1）3.2 mg（10.8 μmol），絲裂霉素C 3.6 mg（10.8 μmol）， 0.03 mol/L HBS緩沖液（pH為 7.4）2 mL，攪拌12 h，期間監控反應液pH，以微量注射器補充0.5 mol/L 氫氧化鈉水溶液維持pH=7.4，減壓蒸干反應液，所得油狀物以硅膠柱色譜分離（氯仿：甲醇 100：1至10：1），得到黃色固體4.1 mg ，收率73.7%。經核磁共振波譜法驗證為目標化合物MMC-DSS， 1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6） δ 8.89 （s， 1H）， 8.49 （s， 1H）， 6.65 （s， 1H）， 6.62 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 6.48 （d， J=8.0 Hz， 1H）， 4.36 （m，2H）， 4.24 （d， J=10.2 Hz， 1H）， 3.76 （m， 2H）， 3.70 （s， 1H）， 3.11 （s， 3H）， 2.85（d， J=16.6 Hz， 1H）， 2.77（d， J=4.5 Hz， 1H）， 2.69（d， J=4.5 Hz， 1H）， 1.66 （s， 3H），1.16 （s， 1H）。

1.3 ?MMC-DSS的體外釋放研究

本研究參考了陳卓[12，13]所發表的絲裂霉素C前藥的體外釋放研究方法。取氯化鈉 6.78 g，氯化鉀 1.38 g，碳酸氫鈉 2.18 g加入1000 mL容量瓶中，加入約500 mL純化水溶解，取氯化鈣 0.084 g溶解于約200 mL純化水后攪拌下加入上述容量瓶中，定容即得人工淚液。以人工淚液5 mL為溶出介質，向其中加入MMC-DSS 15 mg，控制釋放液溫度為（37±0.5）℃，控制攪拌子轉速為約60 r/min。從加入MMC-DSS開始計時，每隔一定時間取釋放液0.2 mL并補加人工淚液0.2 mL，釋放液過濾后用HPLC測定其中絲裂霉素C的濃度。

絲裂霉素C測定的色譜條件為：安捷倫科技C18色譜柱（4.6 mm-150 mm-5μm），乙腈-磷酸緩沖液（15：85），流速1 mL/min，進樣量20μL，柱溫37 ℃，測定波長為365 nm。

2 結果與討論

攣藥MMC-DSS是將丹參素上的羧基與絲裂霉素C上的伯氨基成酰胺鍵。傳統的制酰胺工藝有酰氯法和直接縮合法，即將丹參素上的羧基制成酰氯再與氨基反應或在DCC、DMAP體系下使丹參素的羧基直接與絲裂霉素C的氨基縮合。但是，丹參素的分子中既有羧基也有羥基，如果直接將丹參素與絲裂霉素C在DMAP/DCC、EDC等縮合劑存在的條件下成酰胺，或是將丹參素制備為酰氯再與絲裂霉素C成酰胺，其結果會導致丹參素自身分子間縮合成酯。為了避免這一情況，我們先將丹參素的羧基與N-羥基丁二酰亞胺縮合為不易與羥基反應的丹參素活性酯（丹參素-NHS，化合物1），再與MMC上的伯氨基以酰胺鍵連接，從而以較少的副反應和較簡潔的步驟獲得了目標化合物。

活性酯法相較酰氯法的優勢還在于避免了丹參素的光學活性損失。天然丹參素具有手性，其手性碳為一個手性仲醇，在酰氯法所使用的酸性條件下非常容易發生消旋化[14]，導致產物的光學純度下降，而活性酯法則避免了酸性環境的使用，從而避免了這一問題。

本研究使用了N-羥基丁二酰亞胺酯，即NHS活性酯，其優點在于上述的避免酸性環境使用從而保護了丹參素的光學活性。然后NHS活性在使用過程中還需要注意一些問題，否則將難以獲得所期望的產物。第一，NHS活性酯的穩定性較差，一般在使用時采用原位制備的方式在獲得后不經純化直接用于下一步反應。這是因為常用的柱色譜法所采用的條件容易導致NHS活性酯水解，從而導致產物損失;第二，在獲得NHS活性酯后，應當將其保存在低溫冰箱中，并充氮氣保存，從而避免所攜帶的雜質及空氣中的氧氣及水蒸氣對活性酯的影響。

本研究將絲裂霉素C與丹參素制備的攣藥MMC-DSS，經體外釋放研究發現，其在人工淚液模擬的眼表環境下能夠呈零級緩慢釋放（表1），這驗證了我們對攣藥功能的預期，即藥物在翼狀胬肉患處同時釋放絲裂霉素C及丹參素，兩者通過不同的抑制成纖維細胞增殖機理，可以產生雙靶點協同作用，提高藥效，驗證了課題設計，有望獲得一種新穎的翼狀胬肉治療藥物。

本研究在實驗過程中使用了微量厚壁反應瓶代替傳統上使用的圓底燒瓶。微量厚壁反應瓶具有以下幾個優點：第一，相較于同體積的圓底燒瓶，由于其為細長結構，液面更深，更有利于溫度計的探入測量，同時不容易因反應液在攪拌中飛濺粘在瓶壁上從而影響反應的進行;第二，配合特制的瓶蓋后，因為其壁厚，可以耐壓，可以適合于較高壓的反應條件。這一點對反應工藝研究是十分有利的，使反應溫度的摸索可以不完全受溶劑沸點的限制。在研究中，我們可以利用反應瓶耐壓的特點，將溫度升高至沸點后繼續升溫，這時由于內部密閉耐壓，壓力會逐漸升高，沸點也隨之提高，可以使反應液的溫度提高至溶劑沸點以上，從而探索在該溫度下反應的情況。

3 結 論

設計并通過兩步反應合成了雙靶點攣藥MMC-DSS。通過In Vitro drug release研究表明，其可以以前藥形式靶向于翼狀胬肉患處后逐漸釋放絲裂霉素C與丹參素以產生雙靶點活性，從而獲得了一種新穎的、有望降低副作用的潛在翼狀胬肉治療藥物。

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