膜融合的研究進展及其在藥物運輸方面的應用

蘇瑩瑩 李春艷 李迪

摘?要?膜融合對于生物體的生命活動具有重要的調控作用。細胞內的膜融合在生物體的整個生命周期中發揮了促進細胞內物質運轉的作用，病毒和細胞膜的融合可能標志著生物體生命的終結。然而，由于活細胞的復雜性，對細胞內膜融合過程的認識僅局限于少數細胞膜上的蛋白結構，如可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體（Soluble N-ethyl maleimide sensitive factor attachment protein receptors，SNARE）及其在促進膜融合中的作用。為更好地研究膜融合的機理，常用相關人工模型系統模擬生物膜融合。本文對SNARE促進膜融合的機理、DNA及卷曲螺旋多肽介導的膜融合研究進展，以及膜融合在藥物運輸等方面的應用進行了概述。

關鍵詞?膜融合; N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體; DNA; 評述

1?引 言

生物膜融合是一種常見的細胞生理現象，對調控生物分子的運輸、攝取及釋放具有至關重要的作用[1]，如膜融合調控神經元之間的信號傳導過程、細胞內的胞吞和胞吐過程[2]、病毒轉染[3]和囊泡轉運過程。生物膜上的蛋白和其它生物大分子之間的靜電斥力使生物體內生物膜之間的距離在10～20 nm之間。因此，膜融合的第一步是拉近生物膜之間距離至幾個納米。膜的緊密接觸伴隨著磷脂雙分子層結構的局部破壞，導致柄狀結構的形成。在莖的中間部分，距離較近的脂質雙層膜的外膜首先發生融合。通常認為，莖可擴張成半融合隔膜，其內層脂質是分開的。在最終的脂質重排過程中，半融合柄或者隔膜形成一個小孔，隨著融合的進行，這兩個小孔逐漸增大，使最初的兩個脂室變成一個，并將各室所包含的物質混合在一起，完成融合過程，如圖1A所示[4]。盡管細胞內的膜融合和病毒融合的蛋白質機制有很大的不同，但在融合過程中發生的脂質雙層間的物理變化是相似的。一般認為真核細胞中的膜融合是由可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體（Soluble N-ethyl maleimide sensitive factor attachment protein receptors，SNARE）控制。膜融合的大部分數據是基于SNARE蛋白研究獲取的[5，6]。膜融合過程發生之前，膜上的兩組蛋白分別由兩個卷曲螺旋區域組成，相互作用形成具有四螺旋結構的SNARE復合物，如圖1B所示。SNARE蛋白在膜融合過程中所起作用可由兩種機理解釋：蛋白將兩個磷脂層拉在一起，促進半融合及全融合過程，如圖1A（a）; 另一種，SNARE先分別在單邊的跨膜區域形成融合孔，當融合孔擴大后，跨膜區域會分開，磷脂參與融合孔中，繼而發生融合，如圖1A（b）。研究表明，SNARE復合物可將兩個分子膜拉近至2～3 nm[7]。

研究膜融合的主要方法有以下兩種： 第一種方法是使用已知的融合蛋白。這些蛋白可在體外進行表達，也可用于體內的融合系統。由于體內系統中有很多蛋白參與此過程，所以在體內很難將某種蛋白的影響進行獨立研究。此外，由于生物體內部組成的復雜性，體內的脂質重組研究也常會得到對立的結果。如生物體內常存在密度不均勻的蛋白質及大小不均勻的脂質體等，這些都會導致不穩定融合事件的發生。第二種方法通過合成觸發膜融合的類似物，深入了解蛋白質誘導的膜融合的發生機制。常見的膜融合類似物包括源于自然蛋白的膜融合肽及利用互補的DNA鏈。在膜融合肽誘導的膜融合過程中，多肽在脂質雙層中以螺旋結構存在，導致脂質膜不穩定，促使其發生融合。如病毒和細胞的融合（圖1C）[4]，兩種融合膜之間沒有特異性識別分子，只是融合肽和磷脂膜之間的相互作用即可促進膜的融合。而DNA鏈誘導的膜融合則是通過錨定在不同脂質膜上的DNA堿基互補配對促進膜融合。DNA分子鏈具有高度選擇性且易于合成的優點，DNA納米技術具有可編程性，將膜融合和DNA相結合，拓寬了膜融合的研究領域。Hook等曾通過對DNA鏈進行膽固醇功能化修飾，將DNA鏈輕易地嵌入磷脂雙分子層中，然后利用互補的DNA分子鏈之間的雜交反應將兩個脂質膜結合在一起[8]。

2?SNARE促進膜融合的機理研究

在生物學上，融合蛋白作為促進膜融合的催化劑可幫助兩個生物膜克服融合過程中生物膜之間的排斥力，進而促進膜融合[8]。常見的融合蛋白有SNARE蛋白及病毒融合蛋白[9]。SNARE蛋白是一類生物膜上細胞間特異性和細胞質靶向蛋白的總稱，SNARE假說認為SNARE蛋白由囊泡（v-）SNARE、目標（t-）SNARE、N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白（N-ethylmaleimide-sensitive factor，NSF）和細胞質內的可溶性NSF附著蛋白（Soluble NSF attachment protein，SNAP）組成。即使在NSF和SNAP不存在的情況下，囊泡（v-）和目標（t-）SNAREs也會形成穩定的結構[11]。囊泡融合是最早發現的SNARE介導的一類膜融合，在融合過程中，SNARE蛋白的復合結構可誘導后續的膜融合，SNARE蛋白由疏水的碳末端跨膜域和水溶性的N端區域組成。在識別過程中，最初未結構化的SNARE模體自組裝成四螺旋束，這種四螺旋束能被特定的蛋白解離。通常，螺旋束從氮末端開始形成，之后像拉鏈一樣向跨膜區移動，這種移動過程會對脂質膜產生壓力，促進融合孔的生成，繼而發生膜融合。病毒融合蛋白對于病毒進入細胞的過程起重要作用。病毒入侵細胞的過程，首先是包裹在病毒周圍的融合多肽先嵌入宿主細胞的細胞膜，使融合蛋白的結構發生改變，繼而推動兩個生物膜發生融合。融合多肽也可通過擾動宿主細胞膜的結構促進膜融合，這與SNARE蛋白的組成幾乎相似，即融合蛋白產生一個內在的力，推動兩個生物膜發生接觸，最后導致膜融合。

此外，研究發現，具有卷曲螺旋序列的SNARE模體，可通過相互之間的平行作用形成SNARE復合結構，如圖2所示[12，13]。這種復合結構緊鄰跨膜區，表明SNARE復合結構的自組裝可將突出囊泡和脂質體膜結合在一起，SNARE復合結構可提供膜融合所需能量。隨后，神經元的SNARE結構被證實是由4個平行的α-螺旋組成，2個來自SNAP-25，另外2個分別來自突出融合蛋白和突觸泡蛋白，不同膜上SNAREs蛋白的表征顯示SNARE結構具有相似的四螺旋柱狀結構。

3?天然膜融合蛋白類似物促進膜融合的研究

3.1?通過DNA修飾的脂質體研究膜融合過程

生物膜融合由SNARE家族蛋白嚴格調控，轉運小泡和目標蛋白分子間通過特異性識別發生相互作用，生成SNARE蛋白復合物，促使組成細胞膜的磷脂進行重組，使相鄰的脂質層發生融合。受SNARE促進膜融合機理的啟發，Stengel等[8]利用膽固醇修飾的DNA鏈模擬這種識別過程，如圖3A所示，疏水端的膽固醇可自發地嵌入磷脂層，并作為DNA嵌入磷脂層的錨定端，這種膽固醇修飾的DNA鏈具有定向性，使雜交發生在鏈式區，具有互補序列的DNA鏈修飾的囊泡被拉近，進而促進膜融合。研究發現，嵌入膜內的DNA鏈的數量對膜融合的速率有很大影響?；旌狭字哂休^高的融合效率和融合速率。 Beales等[14]的研究表明，DNA作為可促進膜融合的配受體對，其螺旋的穩定性受內膜的表面張力調控，并且脂質組成對嵌入脂質體表面的互補DNA的融合溫度有很大影響。

2009年，Chan等[15]研究了不同DNA鏈的序列對DNA介導的膜融合的影響，通過在DNA鏈的不同端修飾磷脂，嵌入脂質層之后的互補DNA可形成反向平行雜交，這種雜交方式可拉近兩個膜。然而，在2007年，他們在單個囊泡與基底脂質層融合的實驗中觀察到，由磷脂修飾的DNA介導的膜融合過程中，70%的膜融合處于半融合狀態，只有5%的融合處于全融合狀態，如圖3B所示[16]。他們認為，這可能是錨定在磷脂膜的DNA的甘油醚只插入了磷脂層的一半，半融合后，磷脂修飾的DNA在目標膜中處于自由擴散的狀態從而遠離脂質體。為了驗證這個猜想，他們引入茄尼醇修飾的DNA，茄尼醇是一類C45的類戊二烯醇，當茄尼醇只存在于發生融合的其中一個囊泡或者兩者都有時，膜融合的速率提高了2～3倍，這些結果表明跨膜的錨定基團可提高膜融合的效率。

磷脂修飾的DNA鏈不僅能誘導膜融合，而且可輔助SNARE介導膜融合。2015年，Xu等[17]利用磷脂修飾的DNA實時調控SNARE在膜融合中的作用。磷脂修飾的DNA鏈由21個堿基對組成，將其嵌在膜遠端，通過堿基之間特異性互補雜交可將兩個脂質體橋連在一起，嵌入在膜近端的一條鏈用于控制脂質體之間的間隔距離。利用DNA的互補配對拉近膜距離的同時，t-SNARE和v-SNARE隨著距離的拉近發生相互作用，從而形成SNARE復合物，當DNA的堿基數低于40時，可得到最大融合效率。作為一種操縱本地蛋白程序化的工具，磷脂修飾的DNA可用于調控其它生物過程。2018年，Sun等[18]利用DNA編程介導的膜融合策略，發展了向活細胞細胞質內有效遞送蛋白質的方法。

在DNA介導的單個融合事件的研究手段成熟之后，Loffler等[19]利用DNA的可編程性研究了膜融合的級聯反應。磷脂修飾的DNA介導的膜融合為自上而下地構建納米反應器提供了一個模板。DNA介導的級聯膜融合所需溫度低至50℃，這對于研究在脂質體限域的水相反應中調控水的活性對反應的影響有極大的應用潛能。有效的程序融合可促進新的自下而上合成生物學技術的發展，如多成分人工細胞系統技術。這種具有靶向細胞膜特定位點脂質體的融合技術在藥物靶向及基因傳遞方面有重要的應用前景。

隨著DNA技術的發展，DNA納米結構在細胞膜上的自組裝已成為一個強有力的研究工具[20]。與天然的生物膜相比，合成的磷脂膜結構比較簡單，更利于模型構建[21]。2017年，Peng等[22]在模擬細胞微環境的脂質體膜上，實現了DNA納米柱的自組裝及自組裝的解離的過程。具有DNA手臂鏈的三維DNA納米柱可通過膽固醇修飾固定在膜表面。通過DNA鏈之間的雜交及腳手鏈介導的鏈置換可有效地調控DNA納米柱的自組裝。

3.2?利用卷曲螺旋多肽建立的膜融合研究模型

以上研究方法多是模擬了膜融合的過程，簡要概括了膜融合的基本特征。這些研究所用的模型多是脂質體和脂質體的融合，并未將融合事件擴展至活細胞的研究上，這在很大程度上限制了膜融合在藥物遞送方面的研究。2016年，Mora等[23]受SNARE蛋白結構啟發，建立了利用卷曲螺旋肽互補的相互作用進行完全人工模擬的靶向膜融合模型。這個模型和SNARE介導的膜融合有類似的關鍵性特征。

超分子化學的發展為功能材料的設計提供了很多便捷方法。細胞膜內的蛋白由于相互間的靜電斥力而很難發生相互作用，大分子之間的疏水相互作用則可彌補這方面的不足?；诘鞍踪|之間的疏水相互作用，可對膜融合進行特異性調控[24]。設計互補的卷曲螺旋組成脂肽嵌入脂質體膜中，可有效且快速調控靶向性膜融合[23，25～28]。此類膜融合脂質體是通過將磷脂和脂肽融合在有機溶劑中制備[27]。 Versluis等[29]設計了一種可基于互補脂肽對的，快速促進膜融合的超分子系統。他們通過向普通脂質體中添加水溶性的兩親性多肽誘導脂質體膜融合。這種方法和常見的脂質體制備的方法截然不同，普通脂質體多基于融合肽、糖類、糖肽類及DNA復合物等，該方法可用于脂質體和細胞膜的融合及細胞膜的刺激活化等[30]。

2013年，Zope等[31]利用光敏材料對促進融合的肽進行屏蔽，光敏材料的光誘導效應可很快地去屏蔽，使肽鏈發生相互作用，從而促進兩個脂質體膜進行融合，實現可控融合（圖4A）。2016年，Kong等[32]設計了一種基于卷曲螺旋組成的肽，通過其互補作用，靶向促進膜融合（圖4B）。兩種卷曲螺旋肽分別為E和K，通過將E和K脂質體混合在一起，膜融合可自發地進行。在自然界中，膜融合受時間和空間的高度調控，從而保證融合的正確發生，維持生物體機能的正常運轉。同樣，其融合特性可用于載藥和基因運輸的膜融合系統，從而控制膜融合發生的時間和部位。

4?膜融合研究在藥物運輸方面的應用

穿膜肽和脂質體由于其良好的生物相容性和非入侵性而廣泛應用于藥物運輸的研究。脂質體的尺寸通常小于1 μm，是研究生物或生物物理膜性質的常用模型; 另外，由于其生物相容性及低毒性，常被用作藥物運輸系統。功能化修飾的脂質體可向細胞質內轉運小分子，常見的功能分子有帶正電的磷脂、聚合物、抗體、細胞穿膜肽等。將水溶性的藥物分子包裹在脂質體內也是常用的藥物運輸方法，但有關將親脂性的藥物包裹在脂質體內實現藥物運輸的研究報道較少。受細胞膜上SNARE蛋白的啟發，Mora等[23]開發了一種藥物運輸系統用于靶向膜融合（圖5A），膜融合系統由兩條互補的兩親肽組成，兩條肽分別嵌在不同的膜上，其互補后形成的卷曲螺旋復合物可將兩個對立的細胞膜拉至較近的距離，從而促使膜融合的形成。

2017年，Yang等[33]利用脂質層包裹的介孔二氧化硅納米顆粒，通過膜融合介導細胞內蛋白質的傳遞。蛋白質向細胞質的運輸是納米醫學領域的一個具有挑戰性的課題，因為細胞攝取和溶酶體逃逸的效率很低，阻礙了其在臨床上的應用。該工作設計了一種含有大孔徑（10 nm）圓盤狀腔的二氧化硅納米顆粒（MSNs），用于細胞內蛋白質遞送的研究，并以細胞色素C（cytC）為不透膜的蛋白質研究模型。為確保膠體的穩定性，MSNs表面涂覆了一個融合脂質雙層（LB），細胞攝取由一對互補的卷曲螺旋肽誘導。卷曲螺旋肽誘導的膜融合可使細胞色素C有效地進行細胞遞送，并引發細胞凋亡。在內吞抑制劑的存在下，這些LB涂層MSNs的有效傳遞表明膜融合是細胞攝取的主要機制。這種用卷曲螺旋肽介導膜融合對于細胞內有效遞送無機納米粒子或蛋白質具有普適性。2018年，Bi等[34]利用脂質包裹的磁性納米顆粒實現了磁場引發的藥物釋放，這種新的藥物遞送方法對于癌癥治療具有很大的應用潛力。

互補的卷曲螺旋組成的肽鏈，如E4（（EIAALEK）4）和K4（（KIAALKE）4），其和脂質體相連可組成一類常見的膜融合引發劑。受此啟發，Yang等[35]首次將這種卷曲螺旋肽用于藥物運輸，制備E4肽修飾的脂質體，并在其中包裹遠紅外熒光素TOPRO-3碘負離子（E3-Lipo-TP3），結果表明，E4脂質體可向膜表面表達K4肽的Hela細胞遞送TP3分子。此外，他們用脂質體包裹E4-Lipo-DOX，證實該方法還可向細胞內遞送DOX（圖5B）。將GUV（70% POPC和30%膽固醇）包裹的0.8 mmol/L光澤晶熒光染料和脂肽1孵育，得到功能化的GUV，隨后形成的二聚卷曲螺旋結構可促使脂質體的融合，從而實現目標轉運體3的靶向遞送。最后，在溶液中加入NaCl轉運體3，將外部的氯化物轉化為內部的鹽，導致脂質體內熒光素猝滅。研究表明，與游離的阿霉素相比，E4-Lipo-DOX具有更強的細胞毒性。為了證明E4/K4卷曲螺旋結構適用于體內的藥物運輸，他們將E4-Lipo-DOX和E3-Lipo-TP3注射進入移植有Hela-K的斑馬魚體內，結果表明，E4脂質體可進入Hela-K細胞，E4-Lipo-DOX可抑制癌細胞的增殖。因此，卷曲螺旋結構可有效且有選擇性地用于體內的藥物運輸。

5?總結與展望

脂質轉染試劑及電穿孔試劑盒的開發研究對于細胞和活體的研究至關重要。然而，細胞及生物體是一個極其復雜的微環境，現有研究方法常具有復雜的機制，且其對細胞行為的影響不可預測。膜融合是所有生物體內時刻都在發生，并且對于維持生物體的生命活動具有重要調控作用的事件，嚴格調控神經突觸的傳導、內吞、胞吐等生物過程。理解膜融合的基礎生物物理過程不僅有助于深入了解生命過程，而且能為材料科學開辟一個新的途徑，同時為藥物設計和基因的傳導提供一個強有力的工具。另一方面，膜融合和其它技術的結合，如DNA納米技術等，可很大程度上促進膜融合領域的發展。但是，生物膜的組成并不像現有的研究設計模型那么簡單，其表面含有大量的蛋白及糖類，微小的刺激可能會引起細胞應激反應，而現有的研究方法并不能對所有細胞產生的行為進行合理的解釋。建立正確的膜融合系統，使其組成更加接近真實的生物狀態，有助于深入了解生物的生命過程。

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