低能N+注入誘變選育弱后酸化保加利亞乳桿菌

那治國，唐敬思，王紅梅，錢 鐳，軒詩濤

（1.黑龍江東方學院 食品與環境工程學部，黑龍江 哈爾濱 150066；2.黑龍江東方學院 總務處，黑龍江 哈爾濱 150066）

酸奶作為最主要的發酵乳制品，因其具有特殊的風味和豐富的營養與保健價值，深受消費者的青睞[1]。近年來，我國酸奶的市場規模逐年上升，2017年銷售額已達1 220億元，首次超越牛奶，且每年仍以20%左右的速度快速增長，是最具發展潛力的乳制品之一[2]。然而，由于酸奶是經保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Strep tococcus thermophilus）共同發酵而制得的活菌型產品，在正常發酵結束后的貯藏、運輸和消費過程中，酸奶的pH值會繼續下降，出現后酸化現象，使產品酸味過重和感官質量下降，在一定程度上限制了酸奶產業的發展[3-4]。

目前，控制酸奶后酸化的主要方法有添加天然防腐劑、抑制劑等外源物，調整球桿菌比例，改善工藝水平，改變細胞膜的通透性，采用基因工程和人工誘變育種技術等[5-8]。其中，添加外源物、調整球桿菌比例、改善工藝水平等措施雖然能在一定程度上控制后酸化現象，但酸奶的特有風味和質量將大大降低[8-11]。徹底解決酸奶后酸化問題的關鍵是獲得低溫、低pH值條件下產酸弱的菌株，雖然基因工程技術在菌種的改良上具有顯著效果，但由于合成乳酸的基因非常復雜，目前尚不是很清楚，因此，該方法很難實現[12-13]。而誘變育種尤其是離子注入誘變技術，因其具有育種速度快、操作簡單及高效、高定向性、損傷輕、突變譜廣等特點，因而在優良菌種的選育領域發揮著重要的作用[14-15]，然而，關于N+注入誘變技術在弱后酸化酸奶發酵菌種選育中的應用鮮有報道。另外，由于德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）保加利亞亞種是酸奶后期發酵的優勢菌群，耐酸性較強，是導致后酸化的主要菌種[16-17]，因此，選育弱后酸化的保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus），可有效解決酸奶的后酸化問題。

本研究以保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）DL1為出發菌株，采用低能N+注入誘變技術，并用青霉素處理，選育低pH值條件下產酸弱的菌株，以求有效解決酸奶后酸化問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養基

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）DL1：本實驗室篩選保藏；MRS液（固）培養基（pH值6.2）：北京奧博星生物技術有限責任公司；脫脂乳培養基：12%還原脫脂乳（雀巢），95 ℃滅菌10 min。

1.1.2 生化試劑

青霉素（純度99%）：武漢易泰科技有限公司上海分公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Model-1型多功能等離子體浸沒離子注入裝置：哈爾濱工業大學材料科學與工程學院；2120UV型紫外可見分光光度計：韓國美卡希斯有限公司；S210-B型酸度計：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；CL-32L型自動高壓滅菌器：日本ALP公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機：湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 保加利亞乳桿菌DL1生長曲線的繪制

菌種活化：將實驗室保存的保加利亞乳桿菌DL1接種于MRS液體培養基中，37 ℃、140 r/min條件下培養，按照3%（V/V）的接種量每24 h傳代一次，共傳代三次。

生長曲線的繪制：將活化后的保加利亞乳桿菌DL1接種于MRS液體培養基中，37 ℃、140 r/min條件下培養14 h。按2%（V/V）的接種量轉接到MRS液體培養基中，裝液量為30 mL/250 mL，37 ℃、140 r/min條件下搖床振蕩培養，每隔2 h取出5 mL發酵液，適當稀釋后測定其在波長600 nm處的吸光度值，繪制保加利亞乳桿菌DL1的生長曲線。

1.3.2 低能N+注入誘變處理

菌膜的制備：將活化后的保加利亞乳桿菌DL1接種于于MRS液體培養基中，37 ℃、140 r/min條件培養10～12 h，制成細胞濃度約為1×108CFU/mL的菌懸液。取0.2 mL菌懸液涂布于無菌小培養皿內，無菌室下自然風干，鏡檢，菌體無重疊后進行N+注入。

N+注入誘變處理[14]：將菌膜置于N+注入機中，在真空度為0.6 Pa，注入能量為25 keV，注入劑量為0～2.5×1015ions/cm2的條件下進行氮離子注入，同時以真空為對照。誘變后用1mL無菌生理鹽水洗脫小培養皿中的菌體，得到誘變后的菌懸液。菌懸液經梯度稀釋、涂布培養后按平板菌落計數法[17]進行菌落計數，并計算不同注入劑量菌株的致死率，繪制致死率曲線，從中選取最佳注入劑量。致死率計算公式如下：

1.3.3 青霉素處理

參照HOFHERR L A等[18]的方法。將N+注入處理后的菌株制備成菌懸液，接種于MRS液體培養基中，37℃、140 r/min條件下培養12 h后，25 ℃條件下10 000×g離心10 min，收集菌體，懸浮于pH 4.3、含有2.0 mg/mL青霉素的MRS液體培養基中，42 ℃條件下分別處理1 h、2 h、3 h、4 h、5 h。處理后，離心收集菌體，制備菌懸液，并采用平板菌落計數法進行菌落計數，以未經青霉素處理的為對照，計算致死率，其計算公式如下：

1.3.4 弱后酸化菌株的篩選

將青霉素處理后制備的菌懸液涂布于MRS固體培養基上，37 ℃培養48 h，挑選菌落分布均勻，且菌落數在100～300個之間的平板，通過平板印影法分別接種到pH值為4.3和4.8的MRS固體培養基中，用保鮮膜密封，37 ℃培養。選取在pH 4.8條件下生長，而在pH 4.3條件下不長或生長緩慢的菌落為目標菌株，并以出發菌株為對照，進行脫脂乳發酵及貯藏產酸實驗，比較其在貯藏過程中pH值的變化。

1.3.5 菌株脫脂乳發酵產酸及后酸化驗證

將初步篩選出的突變菌株傳代2次，制作發酵劑。以出發菌株DL1為對照，接種于脫脂乳培養基中，在42 ℃條件下發酵8 h，每隔2 h測定pH值，觀察其發酵產酸情況。待pH值至4.6時取出，于4 ℃冷藏12 h后置于25 ℃條件下保藏72 h，每隔12 h測定pH值，繪制72 h的pH值變化曲線，觀察其貯藏過程中的酸度變化情況，篩選25 ℃保藏期間產酸慢的菌株。

1.3.6 遺傳穩定性實驗

將篩選出的突變菌株在MRS培養基中連續傳8代，分別將第3代和第8代的菌株以2%（V/V）的接種量接種于脫脂乳培養基中，42 ℃條件下發酵，待pH值達4.6后，4 ℃冷卻，25 ℃保藏72 h，每隔12 h測定pH值，以出發菌株DL1為對照，觀察突變菌株遺傳穩定性。

2 結果與分析

2.1 保加利亞乳桿菌DL1的生長曲線

誘變處理時，一般要求出發菌株應處于菌體生長狀態同步、易于變異、重復性較好的對數生長期?？疾毂＜永麃喨闂U菌DL1的生長曲線，確定其對數生長期，結果見圖1。

圖1 保加利亞乳桿菌DL1的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus DL1

由圖1可知，保加利亞乳桿菌DL1在MRS培養基中啟動較快，延遲期較短，4 h后進入快速生長的對數生長期，12 h后菌種生長趨于平穩，因此，確定保加利亞乳桿菌DL1的對數生長期為4～12 h。另外，為了增加可能變異的細胞數，需保證出發菌株具有一定的細胞濃度，因此，選擇對數生長的中后期菌株進行誘變處理，即培養時間為10～12 h。

2.2 N+注入劑量對保加利亞乳桿菌DL1致死率的影響

圖2 不同氮離子注入劑量下保加利亞乳桿菌DL1的致死率曲線Fig.2 Lethality rate curve of Lactobacillus bulgaricus DL1 under different nitrogen ion implantation dose

由圖2可知，在注入能量為25 keV，N+注入劑量為0～1.0×1015ions/cm2條件下，隨著注入劑量的增大，保加利亞乳桿菌DL1的致死率迅速升高，而N+注入劑量在1.0～1.5×1015ions/cm2之間時，致死率隨N+注入劑量的升高出現小幅度的降低，而后隨著N+注入劑量的進一步升高致死率顯著上升，致死率曲線呈現典型的“馬鞍型”[14]。這主要是由于N+注入劑量較低時僅會損傷細胞表面，而隨著N+注入劑量的增加，細胞膜上沉積離子的能量和質量可能會對細胞骨架造成破壞，并間接誘導核仁的損傷，導致細胞死亡，致死率迅速上升，當N+注入劑量進一步上升達到一定數量后，細胞的自我修復功能被激活，致死率有所降低，當N+注入劑量增加到引起的細胞復雜損傷超過細胞修復能力時，菌株致死率再次升高[19]。由于最佳的N+注入劑量應該在致死率曲線波谷區域，故確定保加利亞乳桿菌DL1的最佳N+注入劑量為1.5×1015ions/cm2。

2.3 青霉素處理條件的確定

N+注入誘變處理后的菌液，經37 ℃培養10 h后，在pH 4.3、42 ℃條件下，經2.0 mg/mL青霉素處理不同時間的致死率見圖3。

由圖3可知，采用2.0 mg/mL的青霉素處理能選擇性地殺死在42 ℃、pH 4.3條下生長的保加利亞乳桿菌，從而達到濃縮低pH值條件下不生長菌株的目的[18]。另外，GORINI L等[20]研究表明，青霉素對細菌的致死率在50%左右時，對菌株的濃縮效果最好。因此，采用2.0 mg/mL青霉素對誘變后的菌株在42 ℃條件下處理2 h。

圖3 青霉素處理時間對誘變菌株致死率的影響Fig.3 Effect of penicillin treatment time on lethality rate of mutant strain

2.4 弱后酸化突變菌株的篩選

在“印影”平板上挑取在pH 4.8條件下生長，而在pH 4.3條件下不長或生長緩慢的菌落35個，分別接種于脫脂乳試管中，42 ℃條件下培養，觀察脫脂乳凝乳情況，直接淘汰不凝乳或凝乳較差的突變菌株26株。取凝乳效果較好的9株突變菌，分別標記為DL1-1～DL1-9，傳代2次，制作發酵劑，以出發菌株DL1為對照進行后酸化驗證試驗，比較貯藏過程中各管的pH值變化。最終篩選出在25 ℃下產酸緩慢的突變菌株DL1-3。

2.5 突變菌株DL1-3在脫脂乳中發酵產酸能力

圖4 42 ℃條件下菌株DL1及DL1-3在脫脂乳中的pH值變化Fig.4 pH change of strain DL1 and DL1-3 in skimmed milk at 42 ℃

由圖4可知，42 ℃條件下菌株DL1與DL1-3在脫脂乳培養基中發酵培養時，隨著培養時間的增加pH值均逐漸下降，酸度增加。其中，突變菌株DL1-3的pH值下降速度較出發菌株DL1緩慢，尤其是在0～4 h，而4 h后突變菌株DL1-3的產酸量與出發菌株DL1逐漸接近，發酵培養6 h時，突變菌株DL1-3的pH值降至4.56，與出發菌株DL1的pH值沒有顯著差異（P＞0.05）。因此得出，42 ℃發酵12%脫脂乳時，雖然突變菌株DL1-3在前4 h產酸速度較慢，但4 h后產酸速度有所加快，6 h時與出發菌株DL1的產酸量差異較小。

2.6 突變菌株DL1-3發酵脫脂乳的后酸化性能

由圖5可知，菌株DL1-3與DL1發酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時，隨貯藏時間的增加pH值均逐漸下降，但突變菌株DL1-3與出發菌株DL1相比，后酸化的程度在貯藏12 h后顯著降低（P＜0.05）。其中，突變菌株DL1-3發酵脫脂乳在常溫（25 ℃）條件下放置24 h，pH值仍能維持在4.1左右，貯藏72 h時pH值下降0.78，此時，pH值的降低（后酸化）程度比出發菌株DL1降低了18.8%。

圖5 菌株DL1-3和DL1發酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時的pH值變化Fig.5 pH Change of skimmed milk fermented by strain DL1-3 and DL1 during storage at 25 ℃

2.7 突變菌株DL1-3的遺傳穩定性

將突變菌株DL1-3在MRS培養基中連續傳代8次，考察突變菌株DL1-3第3代與第8代發酵脫脂乳的后酸化性能，結果見圖6。

圖6 突變菌株DL1-3第3代與第8代發酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時pH值的變化Fig.6 pH change of skimmed milk fermented by the third and eighth generations of mutant strain DL1-3 during storage at 25 ℃

由圖6可知，突變菌株DL1-3第3代和第8代發酵脫脂乳在25 ℃條件下貯藏時，pH變化曲線沒有顯著差異（P＞0.05）。結果表明，突變菌株DL1-3具有良好的穩定遺傳性能。

3 結論

采用低能N+注入技術，以保加利亞乳桿菌DL1為出發菌株，在最佳注入劑量（1.5×1015ions/cm2）的條件下進行誘變，并用2.0 mg/mL青霉素處理2 h，通過篩選獲得一株后酸化能力較弱的突變菌株DL1-3，其后酸化程度比出發菌株DL1降低18.8%，且在42 ℃條件下發酵脫脂乳的產酸能力與出發菌株DL1差異較小，同時具有良好的遺傳穩定性。