殼寡糖與干酪乳桿菌對斷奶仔豬生長性能、血清抗氧化酶活性及腸道微生物菌群結構的影響

劉媛媛 解林奇 吳 棟 李 康 陳浩天 宋維平 閆 雪*

（1.北京大北農科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室，北京100192；2.山東衛康生物醫藥科技有限公司，山東臨沂276016；3.沈陽科技學院，遼寧沈陽110167）

2017 年6 月22 日，農業部印發了《全國遏制動物源細菌耐藥行動計劃（2017-2020年）》提出，推進獸用抗生素藥物減量化使用，在2020年底以前，將退出所有促生長類抗菌藥物添加劑品種，飼料端“禁抗”，養殖端減抗、降抗為必然！幼齡動物是抗生素使用量最多的階段，飼用抗生素作為生長促進劑對緩解仔豬早期斷奶應激具有良好的作用效果，因此尋找有效的飼用抗生素替代品成為當前研究熱點。目前飼用抗生素替代品主要包括微生態制劑、低聚糖、酶制劑、植物提取物等[1]。乳桿菌可以黏附、定植于動物腸黏膜表面，對宿主腸道黏膜免疫系統具有調控作用，進而改善仔豬腸道健康[2]。殼寡糖是由2～10個氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的寡糖，水溶性好，可提高斷奶仔豬生長性能，提高血清抗氧化指標，增加有益菌數量[3]。但目前尚未有關于飼料中共同添加殼寡糖和乳桿菌對斷奶仔豬應用效果的研究報道，本試驗通過研究殼寡糖和干酪乳桿菌對斷奶仔豬生長性能、血清中抗氧化酶活性以及腸道微生物菌群結構的影響，旨在為益生菌與益生元在畜禽飼料中科學配伍使用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殼寡糖由山東衛康生物醫藥科技有限公司提供，聚合度為2～10，相對分子量≤2 000 Da，脫乙酰度90%，純度80%。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）粉劑由北京大北農科技集團股份有限公司飼用微生物工程國家重點實驗室提供，粉劑活菌含量為1×1011CFU/g，制備成活菌含量為1×1010CFU/kg，備用。

1.2 試驗動物與日糧

試驗動物選用“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬，基礎日糧配方及營養水平見表1。

1.3 試驗設計與飼養管理

試驗在唐山大北農豬育種科技有限責任公司動物試驗場進行，采用312頭30日齡體重為(7.06±0.02) kg杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，根據“體重相近、公母各半”的原則隨機分成4個處理，每個處理設置6個重復，每個重復13頭豬。分組情況為：飼喂玉米-豆粕型基礎日糧的對照組(A)、每千克飼料添加0.5 g殼寡糖的試驗組（B）、每千克飼料添加1010CFU 干酪乳桿菌的試驗組（C）以及同時添加殼寡糖與干酪乳桿菌的試驗組（D），見表2。豬只自由采食和飲水，試驗進行32 d。

表1 基礎日糧配方與營養水平[4]

表2 不同添加劑試驗分組

1.4 樣品采集與檢測

1.4.1 生長性能的測定

試驗第0 d、第14 d 和第32 d 分別對豬進行空腹稱重，試驗期間準確記錄每天采食量，計算平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）和料重比（F/G），并統計腹瀉率。

1.4.2 血清抗氧化酶活性測定

試驗中期第14 d 和結束時(第32 d)，采集豬前腔靜脈血液，分離血清，于-80 ℃冷凍保存。采用南京建成生物科技有限公司試劑盒檢測血清中相關抗氧化酶活性，如總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等。

1.4.3 糞便微生物的測定

采集第0、14 d 和第32 d 斷奶仔豬糞便，使用天根生化科技(北京)有限公司糞便基因組DNA 提取試劑盒，提取基因組DNA，-20 ℃保存待測。結合變性梯度凝膠電泳（DGGE）與16S rDNA測序技術，分析斷奶仔豬糞便微生物種群結構與多樣性。試驗操作參照曾燕等[5]方法，圖譜分析采用Quantity One(Bio-Rad)凝膠定量軟件。測序結果使用BLAST 在GenBank 數據庫中進行相似性分析。

1.5 數據統計分析

數據采用SAS 軟件8.0 版GLM 程序進行統計分析，多重比較采用鄧肯氏法（Duncan's 法），以P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 殼寡糖與干酪乳桿菌對斷奶仔豬生長性能的影響（見表3）

表3 殼寡糖與干酪乳桿菌對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 殼寡糖與干酪乳桿菌對斷奶仔豬血清抗氧化酶活性的影響（見表4）

表4 殼寡糖與干酪乳桿菌對斷奶仔豬血清中抗氧化酶活性的影響

由表4可知，與A組相比，在第14 d階段B組有提高血清中總抗氧化能力（T-AOC）與過氧化氫酶（CAT）活力的微弱趨勢，但同時也使血清中丙二醛（MDA）含量稍有升高；C組有增加血清中過氧化氫酶（CAT）活力并降低丙二醛（MDA）含量的趨勢；D 組則同時提高了血清中總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活力，且降低丙二醛（MDA）含量；但是各組差異均不顯著（P＞0.05）。與A組相比，第32 d階段，B組顯著提高了谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活力（P＜0.05），并降低丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）；B、C、D組均提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）的活力，但差異不顯著（P＞0.05）；C、D 組使丙二醛（MDA）含量稍有升高，但差異不顯著(P＞0.05)。

2.3 殼寡糖與干酪乳桿菌對斷奶仔豬糞便微生物多樣性的影響

2.3.1 飼喂殼寡糖與干酪乳桿菌14 d 斷奶仔豬的糞便DGGE檢測結果

通過標記條帶測序結果分析可見，仔豬飼喂各組產品14 d后44日齡仔豬糞便中的1號弗林氏丁酸桿菌（Flintibacter butyricus）菌屬的某些菌株在C、D組中較A、B組明顯增多；2號卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatusDSM 20584）菌屬中的某些菌株在D組中較其他組明顯增多（圖1、表5）。圖譜聚類分析與樣品相似度結果顯示：仔豬飼喂各組日糧14 d后44日齡仔豬糞便微生物的聚類現象明顯，說明各組日糧在斷奶仔豬前期對仔豬糞便的微生物組成有明顯影響（圖2、圖3）。

圖1 試驗14 d各組仔豬的糞便DGGE圖譜

表5 試驗14 d各組斷奶仔豬糞便DGGE圖譜中標記條帶測序結果

圖2 試驗14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜聚類分析結果

圖3 試驗14 d各組仔豬糞便DGGE圖譜樣品相似度結果

2.3.2 飼喂殼寡糖與干酪乳桿菌32 d 仔豬斷奶的糞便DGGE檢測結果

仔豬飼喂各組日糧32 d的62日齡仔豬糞便中的1號真桿菌屬（Eubacterium coprostanoligenesHL）中的某些菌株在A、D兩組中較其他組多；2號布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromiiATCC 27255）菌屬中的某些菌株和3 號羅氏弧菌（Roseburia intestinalisDSM 14610）菌屬中的某些菌株在C、D 組中的數量明顯高于A、B 組（見圖4、表6）。仔豬飼喂各組日糧32 d 的62日齡仔豬糞便的微生物組成沒有明顯聚類現象，說明隨著仔豬的成長，個體差異占據主要作用，微生物組成也隨個體差異而聚類分散（圖5、圖6）。

綜上所述，仔豬飼喂各組日糧14 d 后44 日齡仔豬糞便微生物組成區別較明顯。試驗各組聚類明顯，C、D 組對仔豬糞便的微生物組成中某些菌株的影響一致。

3 討論

同時添加殼寡糖與干酪乳桿菌（D 組）對斷奶仔豬在15～32 d 階段生長性能的影響效果顯著，料肉比下降了0.15。劉媛媛等[3]在基礎日糧中添加0.5 g/kg殼寡糖可提高28 日齡斷奶仔豬15～35 d 和0～35 d 這兩個階段的平均日增重并顯著降低料重比。劉偉學等[6]在基礎日糧中添加干酪乳桿菌能夠提高仔豬生長性能。由此可見復合添加D組效果優于單獨使用B組、C組。這與徐晨希等[7]研究殼寡糖和丁酸梭菌對肉仔雞生長性能的影響結果不一致，復合添加并未優于單獨使用的結果。C組降低了斷奶仔豬腹瀉率，本次試驗周期內斷奶仔豬腹瀉并不明顯。張魏偉等[8]研究指出飼喂干酪乳桿菌能有效保護腸道組織結構的生長和發育，可預防斷奶仔豬腸道疾病，但在已出現炎癥時，直接飼喂干酪乳桿菌不會起到明顯的保護和治療作用?？h怡涵等[9]也指出灌喂干酪乳桿菌對斷奶前仔豬ADFI、ADG 和F/G 均無顯著影響，但能顯著降低仔豬腹瀉率，提高斷奶后仔豬ADFI 和ADG，顯著降低F/G，但對斷奶后腹瀉率無顯著影響。

圖4 試驗32 d各組仔豬的糞便DGGE圖譜

表6 試驗32 d各組斷奶仔豬糞便DGGE圖譜中標記條帶測序結果

圖5 試驗32 d各組仔豬糞便DGGE圖譜聚類分析結果

圖6 試驗32 d各組仔豬糞便DGGE圖譜樣品相似度結果

試驗14 d B、C、D組均對提高血清中各抗氧化指標有一定作用，但效果并不顯著（P＞0.05）；試驗32 d B 組顯著提高了血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPx）的含量（P＜0.05），并降低了丙二醛（MDA）的含量（P＞0.05）。這與劉媛媛等[3]研究結果基本一致，0～35 d階段，基礎日糧中添加0.5 g/kg 殼寡糖顯著提高了血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量。本次研究結果再次證明，使用該劑量殼寡糖可以提高血清中超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）的活性，但差異不顯著。說明殼寡糖作為飼料添加劑單獨使用，在提高動物機體抗氧化酶活性方面有很好的功效。飼糧中同時添加殼寡糖和干酪乳桿菌對因斷奶導致的氧化應激也具有一定的作用效果，D組14 d與32 d血清中超氧化物歧化酶（SOD）與過氧化氫酶（CAT）的活性與A組相比有所提高，但差異不顯著。由此可推測殼寡糖與干酪乳桿菌之間存在協同效果，這與李陽等[10]研究肉雞飼糧中添加殼寡糖和干酪乳桿菌可顯著改善動物機體抗氧化性能結果一致。

試驗14 d，C、D 組中弗林氏丁酸桿菌（Flintibacter butyricum）與卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）較A、B 組明顯增多。前一種細菌具有利用糖類和蛋白生產丁酸的能力[11]，而丁酸是腸道菌群的主要代謝產物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等生理功能，對腸道疾病具有有益影響；同時可減少不耐酸的致病菌數量，如大腸桿菌、沙門氏菌和彎曲桿菌，并能促進腸道有益微生物的生長[12]，丁酸還能通過影響腸道pH值而影響消化酶的活性[13]。后一種乳酸菌是可產生雙氧水的益生菌，常用于預防與治療細菌性陰道炎[14]，可降低因致病菌引起的促炎因子的表達預防腹瀉[15]。飼喂干酪乳桿菌或與殼寡糖配伍可有效增加仔豬腸道抗炎性與產丁酸的益生菌數量。試驗32 d，A、D兩組中真桿菌屬（Eubacterium coprostanoligenes）較其他組多；C、D 組中布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）和羅氏弧菌（Roseburia intestinalis）的數量明顯高于A、B組。以上三種菌均為有益菌：Eubacterium coprostanoligenes可使膽固醇降解為能被腸道吸收的糞醇并排出體外，布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）通過消化食物釋放能量[16]，羅氏弧菌（Roseburia intestinalis）通過分解糖產生丁酸[17]。

綜合以上分析結果，殼寡糖作為飼料添加劑有顯著的抗氧化效果；干酪乳桿菌則可提高腸道益生菌數量改善斷奶仔豬腹瀉率；同時添加殼寡糖和干酪乳桿菌可以有效提高斷奶仔豬的飼料轉化率，并提高腸道有益微生物數量，使仔豬腸道更健康。