菠蘿皮渣糯米果酒發酵中成分變化及抗氧化研究

林麗靜，馬麗娜，2，黃曉兵，龔霄，吳子健

（1.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，海南省果蔬貯藏與加工重點實驗室，廣東湛江524001；2.華中農業大學食品科技學院，湖北武漢430070；3.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

菠蘿[Ananas comosus （L）Merrill]屬于鳳梨科（Bromeliaceae），鳳梨屬（Ananas Merr.）多年生單子葉常綠草本植物，是世界三大重要熱帶水果之一。菠蘿原產于南美洲巴西、巴拉圭的亞馬遜河流域等熱帶地區，現在世界82 個以上的國家種植，菠蘿是一種多汁、香氣突出且營養價值高的熱帶水果。成熟的菠蘿果實中含有豐富的糖、礦物質、有機酸、維生素和蛋白酶等，脂肪和膽固醇含量較低[1]。菠蘿在加工生產過程中能產生25%~50%的加工副產物[2-3]。研究表明這些菠蘿皮渣同樣含有豐富的汁，風味和營養成分與果肉相差較小，其中新鮮菠蘿皮渣水分含量為81.34%，0.60%～0.77%的有機酸，22 mg/100 g VC，6.10%總糖，2.50%還原糖含量，蛋白質含量為0.64%，總酸含量為2.09%，脂肪含量為0.32%，金屬元素如K、Ca、Zn 等含量較高[4]。為充分利用資源，國內外對菠蘿皮渣的開發利用進行了大量研究，主要是從加工副產物中提取黃酮、多酚等功能活性成分、發酵沼氣和飼料等，對菠蘿廢棄物發酵果酒也有研究[5-6]。

本試驗采用菠蘿皮渣發酵果酒，并與我國傳統的糯米酒混合發酵，研究菠蘿皮渣糯米果酒在發酵過程中，糖度、蛋白質、黃酮、多酚等主要功能成分以及抗氧化作用，全面研究菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中物質變化規律，為菠蘿皮渣的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菠蘿（卡因品種）：廣東省湛江市；白砂糖：湛江華資農墾糖業發展有限公司廣豐分公司；QA23（簡稱Q）酵母：上海杰兔工貿有限公司；單糖標準品（Fluka-73173）、65%~68%優級純硝酸（Supelco-47267）、鐵離子、銅離子標準溶液[優級純（65%~68%）]、乙醇色譜純（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；-OH 自由基試劑盒（100 管/96 樣）、總抗氧化能力試劑盒（50 管/48 樣）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1780 紫外可見分光光度計、LC-20 A 高效液相色譜儀：日本島津公司；SKD-1000 自動凱氏定氮儀：上海沛歐分析儀器有限公司；TR320 高溫消解爐：北京綠野創能機電設備有限公司；Agilent 7900 電感藕合等離子質譜：美國安捷倫科技公司；WX-8000 微波消解儀：上海屹堯儀器科技發展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菠蘿皮渣糯米果酒發酵工藝流程

菠蘿→清洗→削皮→菠蘿皮渣榨汁→調配糖度到20%→100 ℃，30 min 殺菌→冷卻→接種發酵→28 ℃主發酵7 d→過濾→加入30 %糯米酒后陳釀發酵60 d→過濾→澄清→罐裝→菠蘿皮渣糯米果酒

1.3.2 維生素C（VC）含量的測定

VC標準溶液配制：精密稱取0.200 0 g VC，加20 mL乙酸溶液（2 mol/L）溶解后移入100 mL 棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，制備成2.0 g/L VC標準儲備液。吸取5.0 mL 置于100 mL 棕色容量瓶中，加5 mL 乙酸鋅溶液，用水稀釋至刻度，混勻，得到0.1 g/L VC標準使用液。

VC標準曲線繪制：吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL VC標準使用液，分別置于10 mL 容量瓶中，各加0.3 mL乙二胺四乙酸溶液（0.25 mol/L）、0.5 mL 乙酸溶液（0.5 mol/L）、1，25 mL 固藍鹽B 溶液（2 g/L），加水稀釋至刻度，混勻，室溫（25 ℃）放置20 min 后，以零管為參比，于波長420 nm 下測定吸光度值。以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣品測定：精密吸取適當稀釋后的樣品1 mL，按上述標曲制作方法測定，根據標準曲線計算樣品中VC含量。

1.3.3 黃酮、多酚含量的測定

黃酮測定：參照文獻[7]，測定菠蘿皮渣糯米果酒中總黃酮含量。采用蘆丁標品作為對照品，質量濃度為縱坐標，吸光度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程為：y=12.512x-0.028 8，R2=0.999 1。

樣品吸取量為2mL 于10mL 容量瓶中，加0.05 g/mL NaNO20.50 mL，搖勻放置6 min，再加0.10 g/mL Al（NO3）3溶液0.50 mL，搖勻，放置6 min，再加0.04 g/mL NaOH溶液4 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，放置15 min，以試劑空白為參比，于510 nm 處測定吸光度值。由回歸方程計算樣品總黃酮含量。

多酚測定：參照文獻經過修改后測定菠蘿皮渣糯米果酒中多酚含量[8]。以沒食子酸為標準對照品，分別配成1.60、2.40、3.20、4.00、4.80 μg/mL 的沒食子酸，作標準曲線，回歸方程為：y=0.0861x+0.019 6，R2=0.999 3。

準確吸取150 μL 酒樣置于10 mL 容量瓶中，依次加4 mL 10 %福林酚，3.2 mL 7 % Na2CO3放置1 h，在765 nm 下測定吸光度值。由回歸方程計算樣品多酚含量。

1.3.4 蛋白質含量的測定

樣品前處理：吸取2 mL 菠蘿果酒，移入干燥的100 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸銅、6 g 硫酸鉀及20 mL 濃硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶置于高溫消解爐上。小心加熱，待內容物全部炭化泡沫完全停止后，保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續加熱0.5 h~1 h，取下放冷。同時做試劑空白試驗。

試樣分析：向接收瓶內加入10.0 mL 硼酸溶液及1 滴~2 滴混合指示液，并使冷凝管的下端插入液面下，將定氮瓶置于定氮儀上機檢測。取下接收瓶以鹽酸標準滴定溶液滴定至終點，顏色由酒紅色變成綠色，pH 5.1。同時做試劑空白。

1.3.5 糖含量的測定

參照GB/T 5009.8-2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》。

樣品前處理方法：吸取2 mL 菠蘿皮渣糯米果酒于100 mL 錐形瓶中，加水30 mL，渦旋，離心取上清。

1-苯基-3-甲基-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methylpyrazolone，PMP）衍生化：向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L 的PMP 試劑和0.3 mol/L 的NaOH 溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70 ℃反應30 min。冷卻至室溫（25 ℃），加入0.3 mol/L HCl 0.5 mL，充分混勻。加入1 mL 氯仿。充分振蕩萃取，去除氯仿層，共萃取3 次。水層用0.22 μm 濾膜過濾后，待上機。

色譜條件：色譜柱：Thermo C18柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：0.1 mol/L pH 7.0 磷酸鹽緩沖溶液∶乙腈=82 ∶18（體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量：10 μL；波長：245 nm。

1.3.6 氨基酸含量的測定

樣品前處理：取0.50 mL 菠蘿皮渣糯米果酒于20 mL 的水解管中，加入16.00 mL 6 mol/L 的鹽酸溶液，真空脫氣30 min，充氮封管，在110 ℃下水解22 h~24 h，取出冷卻后，轉移至50 mL 容量瓶中，并用去離子水定容。準確取1 mL 水解液于小瓶中，于真空中脫酸抽干，加1.00 mL 水再抽干，再加1.00 mL 水再抽干，準確加入1.00 mL 0.02 mol/L 的鹽酸溶液，充分溶解備用。

精密量取上述溶液500.00 μL，置于5 mL 塑料離心管中，精密加入1 mol/L 三乙胺乙腈溶液250.00 μL，混勻，精密加入0.10 mol/L 異硫氰酸苯酯乙腈溶液250 μL，混勻，室溫（25℃）放置1 h，加2.00 mL 正己烷，劇烈振搖，放置10 min，取下層溶液用0.22 μm 的水相膜濾膜過濾待用。

色譜條件：色譜柱C18（4.6×250 mm×5 μm）；流動相A 0.10 mol/L 乙酸鈉-乙腈（97 ∶3）（用乙酸調節pH 6.50）；流動相B 乙腈-水（4 ∶1）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。

1.3.7 金屬離子含量的測定

標準溶液的配置：吸取鐵、銅標準溶液，用5%HNO3將標準溶液稀釋成20 mg/L 的儲備液，取20 mg/L的儲備液再次稀釋為200、400 μg/L 的儲備液，取200、400 μg/L 儲備液適量依次配制成0、8、16、24、32、48、64 μg/L 的系列標準溶液，搖勻待用。

前處理方法：稱取1 mL 樣品至聚四氟乙烯消解罐中，加入5.00 mL 硝酸。靜置，反應結束后，密封，放入微波消解儀消解。

待溫度冷卻至50 ℃以下后，取出消解罐放入通風櫥中，打開消解罐，用超純水潤洗，轉移至50 mL 容量瓶中，至少潤洗3 次~4 次，用超純水稀釋定容至刻度，待測?？瞻讓φ胀ㄌ幚?。將溶液過0.45 μm 水相濾膜后上機檢測。

1.3.8 抗氧化能力的測定

DPPH 自由基清除率測定方法：參照文獻[9]。分別取100、80、60、40、20 μL 酒樣與10 mL 容量瓶中，定容。將不同濃度的酒樣2 mL 與2 mL DPPH 乙醇溶液混勻，與暗處反應30 min，于517 nm 下測定吸光度值為A1。2 mL 水與2 mL DPPH 乙醇溶液混勻，測定吸光度值為A2。2 mL 不同酒樣與2 mL 水混勻，測定吸光度值為A3?？寡趸宄杂苫芰τ冒胍种茲舛龋↖C50）表示，IC50越小，自由基清除能力越強。

ABTS+自由基清除率測定方法：參照文獻[10]。分別取250、200、150、100、50 μL 酒樣與10 mL 容量瓶中，定容。將不同濃度的酒樣2 mL 與2 mL ABTS 反應液混勻，與暗處反應4 min，于734 nm 條件下測定吸光度值為A1，用蒸餾水代替酒樣與ABTS 混勻測定吸光度值為A0。ABTS+自由基清除率/%=（A0-A1）/A0×100，并通過SPSS 計算IC50值。

羥自由基測定：按照羥自由基測定試劑盒中的說明方法進行測試。

總抗氧化能力測定：按照總抗氧能力測定試劑盒中的說明方法進行測試。標準曲線為：y =13.344x+0.045 7，R2=0.999 0。

2 結果與分析

2.1 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中VC 含量的變化

VC具有較強的抗氧化性，在·OH 清除能力方面作用突出，VC含量隨發酵時間的變化如圖1 所示。

圖1 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中VC 含量變化Fig.1 Changes of VC during pineapple peel glutinous rice wine fermentation

在發酵前期，VC含量為0.70 g/L，隨發酵時間增加，含量逐漸減少，至第6 天時，減少了0.24 g/L，可能是發酵初期，酵母需要有氧呼吸產熱，導致溫度較高，且有大量氧氣存在導致VC氧化分解[11]。VC含量在6 d~10 d 時迅速增加，從0.46 g/L 增加至0.73 g/L，可能是隨著發酵的進行，微生物分解菠蘿皮渣，酒精度升高，VC得到浸提溶于酒液中。

2.2 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中黃酮、多酚含量的變化

圖2 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中黃酮、多酚含量變化Fig.2 Changes of the flavone and polyphenol contents during the pineapple peel glutinous rice wine fermention

菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中黃酮、多酚含量變化見圖2。多酚和黃酮含量對果酒的保健作用和品質有密切關系。如圖2 所示，黃酮在發酵過程中呈先升后降的變化趨勢。發酵前8 d 黃酮含量增加較快，從0.33 mg/L 升高至0.41 mg/L，這可能是菠蘿皮渣中黃酮含量較多，隨著發酵的進行，酒精度增加，黃酮浸提量增大[12]。多酚含量在發酵前6 d 降低0.03 g/L，6 d~15 d時迅速增加，由0.63 g/L 增加至0.70 g/L，在15 d~20 d 時多酚含量迅速降低至0.59 g/L，之后維持穩定?？赡苁前l酵前期酵母代謝旺盛，產生大量有機酸與酚類物質結合、形成酚酸類物質，導致總酚含量減少，隨著酒精度的升高和菠蘿皮渣浸泡時間的延長，產生羥基類肉桂酸并形成酚類導致總酚含量升高，與文獻[13]中多酚變化趨勢一致。在發酵第15 天后黃酮、多酚含量都明顯降低，可能是多酚類物質氧化聚合以及與蛋白質和其它細胞殘余物結合和沉淀，有些酚類易受貯藏溫度、含氧量及果實成分等因素的影響而分解[14]。

2.3 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中蛋白質含量的變化

菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中蛋白質含量變化如圖3 所示。

研究表明發酵前期蛋白質含量迅速升高，由0.15 g/100 g 增加至0.24 g/100 g，可能是菠蘿皮渣在纖維素酶和果膠酶的作用下分解，使蛋白質融入發酵醪中。在發酵8 d 后蛋白質含量緩慢上升，可能是糯米酒中蛋白質含量較高，慢慢融入發酵醪這與文獻[15]報道中蛋白質變化趨勢一致?？赡苁遣ぬ}皮渣糯米果酒發酵過程中加入氮源，使酵母在整個發酵過程中可吸收氮含量充足，而沒有利用菠蘿皮渣中蛋白質含量有關。而在貯藏后期蛋白質含量緩慢降低，可能是部分蛋白質與單寧類物質結合形成沉淀所致。

圖3 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中蛋白質含量變化Fig.3 Changes of the protein during the pineapple peel glutinous rice wine fermenteion

2.4 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中糖含量的變化

菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的變化結果見表1。

酵母發酵過程是將糖轉化為酒精的過程，果酒中糖的濃度與發酵進程密切相關，發酵過程中釀酒酵母將葡萄糖可轉化成2，3-丁二醇和乙酸乙酯，果糖降解為苯甲醇和苯乙醇等；蔗糖可促進辛酸乙酯、癸酸乙酯等的生成，使果酒甜香[16]。發酵醪采用白砂糖調整糖度，因此發酵初始蔗糖含量較高，蔗糖不斷水解為葡萄糖和果糖，但由于酵母代謝較快，因此發酵醪果糖和葡萄糖并沒有大量積累[17]，其中2 d~4 d 時蔗糖降低最快，從66.81 g/L 下降至0.24 g/L，至第25 天時蔗糖已被酵母利用完全。發酵過程中葡萄糖和果糖先降后升又降，前6 d，葡萄糖和果糖含量分別降低了55.86 g/L和38.74 g/L，第8 天葡萄糖和果糖含量增加，可能是加入的糯米酒糖含量較高所致。菠蘿皮渣糯米果酒中葡萄糖和果糖含量到第60 天分別降低了56.09 g/L 和38.61 g/L，葡萄糖的消耗量大于果糖，與文獻報道相一致，表明酵母對葡萄糖利用率高[18]。

表1 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中糖含量變化Table 1 Changes of the sugar during the pineapple peel glutinous rice wine fermenteion

2.5 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中氨基酸含量的變化

對菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中17 種氨基酸含量進行測定，結果見表2。

表2 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中氨基酸含量變化Table 2 Change of amino acids in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

酒中的氨基酸主要來源于原料和酵母菌體蛋白質的降解，在發酵過程中酵母幾乎可利用所有的氨基酸形成高級醇、揮發酸和酯類物質。發酵初期氨基酸含量都增加，第6 天時增加了0.88 g/L，可能是酵母分解菠蘿皮渣，使氨基酸溶出。隨后氨基酸含量降低，第15 天總氨基酸含量為1.44 g/L，可能是發酵后期氮源和碳源缺乏，酵母開始利用氨基酸代謝繁殖。天冬氨酸脫氨在一些細菌作用下后降解，轉化成2，3-丁二醇，第10 天后天冬氨酸含量降低了0.16 g/L，2，3-丁二醇含量升高為1.22%[19]；第6 天~第10 天后蘇氨酸含量降低了0.05 g/L，使乙酸含量升高。胱氨酸和蛋氨酸呈先平穩后升又降又升的變化趨勢，組氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸呈先升后降又升的變化趨勢，纈氨酸呈先升后降又平穩的變化趨勢，異亮氨酸呈先降后升的變化趨勢，酵母利用異亮氨酸作為主要營養氮源而快速繁殖。發酵結束后脯氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、胱氨酸含量較高，都達0.20 g/L 以上，這些氨基酸呈甜味和鮮味，苦味的氨基酸含量較低，使菠蘿皮渣糯米果酒入口鮮爽、口味甘甜柔和。在氨基酸中，L-纈氨酸，L-亮氨酸和L-苯丙氨酸分別通過Ehrlich 途徑分解代謝產生異丁醇，異戊醇和2-苯乙醇。發酵結束后17 種氨基酸含量與發酵開始相比均有增加，第60 天時菠蘿皮渣糯米果酒總氨基酸含量達2.78 g/L，賦予菠蘿皮渣糯米果酒較高的營養價值。

2.6 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中金屬離子含量的變化

菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中鐵離子和銅離子含量的變化結果見表3。

表3 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程金屬離子含量變化Table 3 Change of metal ion in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

果酒中含有豐富的礦物質，大多數可被人體所需，如Fe 和Cu 等微量元素。這些微量元素主要來源于原料和釀造設備，并隨著發酵的進行參與酵母代謝。鐵離子是細胞色素和過氧化物酶的重要組成成分，對果酒色澤具有主要影響，但過量鐵離子的存在會加速酒中多酚類物質氧化，導致酒體渾濁。銅離子參與超氧化物歧化酶的組成，銅離子含量較高時會嚴重抑制酵母生長，使酒精度低，殘糖量高[20]。在國家標準GB/T27588-2011《露酒》中規定，露酒中鐵離子含量≤8.00 mg/L，銅離子含量≤1.00 mg/L，超標的果酒不允許上市銷售，因此在發酵中應對鐵離子和銅離子嚴格控制。在整個發酵過程中，銅離子含量變化較小，這與文獻[21]報道結果一致，可能是酒體對銅離子吸附作用強有關。發酵前期鐵離子含量逐漸減少，與第2 天相比，鐵離子含量分別減少了588.32 mg/L，可能是發酵前期酵母代謝旺盛，鐵離子被酵母吸收后沉降，排出[22]。在發酵后期，鐵離子含量呈上升趨勢，可能是沉淀中酵母自溶，使細胞壁和細胞質中金屬離子溶出。菠蘿皮渣糯米果酒發酵采用皮渣為原料，且在發酵后期對皮渣進行壓榨，使酒腳中鐵離子溶于酒中，導致鐵離子升高，后期由于澄清劑的加入，使鐵離子沉降而較少。發酵過程中鐵、銅金屬離子不斷變化，陳釀60 d 時菠蘿皮渣糯米果酒金屬離子含量較低，分別為2.46 mg/L 和0.07 mg/L，遠小于國標中鐵、銅離子的限量，有利于果酒穩定。

2.7 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中抗氧化能力的變化

酚類、黃酮和VC等物質的含量和種類主導果酒抗氧化活性[23]，如圖4、圖5 所示。

圖4 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中DPPH·和ABTS+自由基清除率變化Fig.4 Changes of the IC50 of DPPH·and ABTS+free radical scavenging rate in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

圖5 菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中-OH 自由基清除率和總抗氧化能力的變化Fig.5 Changes of the IC50 of-OH free radical scavenging rate and the antioxidant capacity in pineapple peel glutinous rice wine during fermentation

菠蘿皮渣糯米果酒發酵和陳釀過程中ABTS+·、DPPH·清除能力先下降后上升，總抗氧化能力呈先上升后下降，與黃酮和多酚含量變化趨勢基本一致。羥自由基清除能力呈先降后升的變化，在第4 天達到最低10.81 mg/mL，可能是前4 天VC和多酚含量都降低所致。從15 d 開始，菠蘿皮渣糯米果酒抗氧化能力明顯降低，陳釀60 d 時，菠蘿皮渣糯米果酒中自由基清除能力IC50值分別為（19.33±0.38）、（34.00±0.01）、（12.54±0.13）mg/mL，總抗氧化能力為（5.95±0.12）U/mL，與發酵15 d 相比IC50值分別升高（6.36±0.06）、（5.39±2.26）、（1.46±0.05）mg/mL，總抗氧化能力降低了（2.22±0.15）U/mL，主要是15 d 后總酚、多酚和VC含量不斷降低，使抗氧化能力不斷減弱[24]。

3 結論

菠蘿皮渣糯米果酒發酵過程中VC含量先降后升又降，第10 天達到最大，第60 天時降低了0.20 g/L；黃酮含量在前8 d 迅速增加至0.41 g/L，到第60 d 又降低為0.34 g/L，多酚含量在15 d～20 d 時迅速降低至0.59 g/L，之后維持穩定；至第4 天蛋白質含量增加至0.24 g/100 g，之后維持穩定，蔗糖在整個發酵過程中逐漸降低，而在菠蘿皮渣糯米果酒中葡萄糖和果糖含量呈先降后升又降，第60 天時葡萄糖和果糖含量分別降低56.09 mg/L 和38.61 mg/L；在發酵結束后17 種氨基酸含量與發酵開始相比均有增加，除脯氨酸外，其他氨基酸均小于菠蘿果汁中氨基酸含量，但較高的氨基酸含量使果酒具有較高的營養價值。鐵、銅金屬離子在發酵過程中不斷變化，但發酵結束后金屬離子含量較低，分別為2.46 和0.07 mg/L，遠小于國標中鐵、銅離子的限量，有利于果酒穩定。菠蘿皮渣糯米果酒的DPPH自由基和ABTS+自由基清除能力較強，IC50值分別為19.33 g/L 和34.00g/L。