響應面設計優化麗江海棠果果汁飲料配方

童觀珍，樊瑩潤，李澤林，肖麗宏，付曉萍，范江平

（云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明650201）

海棠果富含豐富的黃酮和多糖等活性成分，具有抗衰老[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3-4]等作用，其藥用價值早在《本草綱目》就有記載：“酸甘平、無毒、治泄痢”[5]。海棠果果實中還含有豐富的常量營養物質和微量元素，其中粗蛋白占3.12%，是蘋果、梨的1.5 倍，每100 g 果實含524.70 mg 氨基酸，其氨基酸組成中脯氨酸和天門冬氨酸的占比最大，分別為12.24 g/kg 和11.16 g/kg[6]；并且該果實中的粗纖維占7.48%，粗纖維作為人體不可吸收的膳食纖維，可加快人體的腸道蠕動和代謝，緩解現代人的便秘排毒癥狀；果實中的微量礦物元素鈣、磷、鋅、鐵也大量存在[7]，因此對于海棠果的營養功能特性正引起科研人員的興趣，并對此開展深入研究。目前對海棠果的加工利用已有果酒、果醋、果茶等產品[8-10]，也有從果實中提取天然紅色素等工藝的探究[11]。麗江海棠果（Malus rockii Rehd.），是產自云南省麗江市的一種薔薇科蘋果屬的果實[12]，是云南特有的野生資源，其未成熟果實較為酸澀，成熟后果實呈鮮紅色，口感酸甜可口，細脆多汁深受當地居民喜愛，據當地居民介紹，有關節疼痛，兒童小便不暢時，都會食用麗江海棠果來得到緩解。在《中國納西康巴醫藥學》中也能夠找到關于麗江海棠果入藥的證據。目前麗江海棠果消費方式主要是鮮食，其精深加工產品的開發利用還很少見報道。

Box-Behnken 設計簡稱BBD，是響應面試驗設計的常用方法，通過多元二次方程擬合各因素與效應值的函數關系，對回歸方程的分析來優化工藝，解決多種變量關系；比起正交試驗，它可有效的，預測性更好的評價因變量和自變量之間的非線性關系[13]，在藥物有效成分提取、食品加工中被廣泛應用[14-16]。因此，本試驗在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken 法優化麗江海棠果果汁飲料的配方條件，得出最佳的配方，以期為麗江海棠果的開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麗江海棠果：產自云南省麗江市玉龍縣拉市鄉，鮮果采摘后，運往云南農業大學畜產品加工工程中心-20 ℃冷庫保存備用。白砂糖：耿馬南華糖業有限公司；β-環糊精：郁南縣永光環狀糊精有限公司；檸檬酸：濰坊英軒實業有限公司；白砂糖、β-環糊精、檸檬酸均為食品級。

1.2 儀器與設備

T6 新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；HX-PB811 破壁機：佛山市海迅電器有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；BS224S 電子天平：北京賽多利斯儀器系統有限公司；H3-18K 臺式高速離心機：湖南可成儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

麗江海棠果果汁飲料加工工藝流程及操作要點：

1.3.1.1 麗江海棠果果汁的制備

選擇無病無霉爛、新鮮成熟的海棠果果實清水洗凈、去蒂，按料水比1 ∶3（g/mL）加入超純水，倒入破壁機中破壁3 min，分別用200 目和400 目紗布2 次過濾分離的到澄清透明的海棠果果汁。

1.3.1.2 調配

按試驗設計將一定比例的海棠果果汁與白砂糖、檸檬酸、β-環糊精混合，加水定容至所需體積，混勻后均質處理。

1.3.1.3 均質

為便于添加劑更均勻的分布在溶液中，同時提高成品的整體感官分值，需用均質機對飲料進行均質處理，采用20 MPa，均質兩次為宜。

1.3.1.4 滅菌

為保證果汁中VC和花青素等營養物質不被破壞，采用沸水浴滅菌處理，飲料灌裝封口后，95 ℃下滅菌20 min，室溫25 ℃冷卻或在4 ℃冷庫冷卻得到成品。

1.3.1.5 穩定性試驗

將成品置于4 ℃冷庫過夜，通過飲料的透光性來檢測飲料的穩定效果。

1.3.2 感官評定方法

配比的優劣將從色澤、口感、香氣、組織狀態4 個方面對海棠果果汁進行整體感官評價，滿分為100 分，其中口感和色澤各為30 分，香氣和組織狀態各為20分，選擇10 名有食品專業背景的人員對成品進行感官評價，小組人員身體健康，無不良嗜好，味覺靈敏，在正式評定前進行相應指導，果汁的感官評定標準如表1。

表1 海棠果果汁飲料感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Malus rockii Rehd.juice beverage

1.3.3 單因素試驗設計

本試驗以風味、口感、組織形態、香氣4 個方面為評價指標進行單因素試驗，選取原果汁添加量、白砂糖、檸檬酸、β-環糊精4 個因素進行單因素試驗，每個因素取6 個水平，各因素水平分別為：果汁（40 %、50%、60%、70%、80%、90%），白砂糖（0%、2%、4%、6%、8%、10%），檸檬酸（0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%），β-環糊精（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）。綜合以上各因素對果汁的感官評價和透光率的影響。

1.3.4 透光率測定

將配置好的海棠果果汁在4 ℃冷庫冷藏過夜，觀察果汁的沉淀情況，后用高速離心機在轉速為5 000 r/min條件下離心5 min，取上清用紫外分光光度計在625 nm處測定吸光度[17]，并以超純水為參比，具體計算公式如（1）所示。

式中：A 為飲料的透過率；A0為超純水的透過率。

1.3.5 麗江海棠果果汁配方優化

在單因素基礎上，選擇原果汁添加量、白砂糖、檸檬酸、β-環糊精四因素三水平，以感官分值為指標，采用Design-Expert8.0.6 軟件的Box-Benhnken 響應面設計優化海棠果果汁飲料的配方，因素水平編碼見表2。

表2 海棠果果汁響應面因素水平表Table 2 Response surface factors and levels of Malus rockii Rehd.juice

1.3.6 微生物指標測定

菌落總數的測定：參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》；大腸菌群的測定：參考GB 4789.3-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 原果汁添加量對海棠果果汁飲料品質的影響

海棠果原果汁呈鮮紅色，且無明顯沉淀，口感較為酸澀，因此原果汁量對飲料的整體感觀有重要影響，考察果汁用量對海棠果果汁品質的影響，如圖1 所示。

圖1 原果汁添加量對海棠果果汁飲料品質的影響Fig.1 The effects of raw juice addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由圖1 可知，當果汁的添加量達到70%左右時，飲料的口感、色澤評價均較好，而低于此添加量時，則口感稍顯寡淡，風味不足，顏色呈粉色，果汁添加量高于80%時，則過于酸澀，整體口感評分不高，其透光率因果汁的增加明顯降低，原因在于果汁原有的天然紅色素和能透過濾布的細小懸浮物的存在影響了整體的感官和透過率，這說明合適果汁的添加量對提高海棠果果汁感官品質有重要影響，原果汁中獨特的風味物質使果汁的口感濃郁香氣宜人，添加量過大時，酸度過高，且澀味嚴重，酸甜比失調，并且飲料中有機酸占比過大會使其整體感官分值降低，同時飲料中的單寧與蛋白質分子之間，蛋白質與色素會產生聚集而產生沉淀，最終使得飲料的組織狀態和口感變差[18]，果汁中的總酸可與白砂糖形成適宜的糖酸比，同時考慮到經濟成本，原果汁添加量在70%左右為宜。

2.1.2 白砂糖添加量對海棠果果汁飲料品質的影響

白砂糖添加量對海棠果果汁飲料品質的影響見圖2。

圖2 白砂糖添加量對海棠果果汁飲料品質的影響Fig.2 The effects of white sugar addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

海棠果中含有大量的有機酸及果糖，白砂糖可與果汁風味物質中的果糖產生味覺協同作用，合理的糖酸比例與飲料的口感密切相關，由圖2 可知，白砂糖的添加對果汁透光率影響不大，白砂糖已較好的分散在果汁中，在飲料中加入不同比例的白砂糖，當添加量為8%時，海棠果飲料的綜合感官品質最佳，與不添加白砂糖的組差值20 分，白砂糖添加量少和過多都對飲料的整體感官評分產生較大的影響，可能是適量的白砂糖可與果汁中的風味物質和甜味物質產生良好的協同作用，香味濃郁，甜味醇厚，但添加量過多時，白砂糖甜度太高過于突出且單一，掩蓋了海棠果果汁原有的風味，同時酸甜比比例失調，整體口感變差。

2.1.3 檸檬酸添加量對海棠果果汁飲料品質的影響

果汁飲料生產加工過程中，常因酚類的存在使果汁氧化發生褐變，檸檬酸作為一種常用的果汁護色添加劑，通過降低果汁pH 值螯合金屬離子，抑制氧化酶活性來達到護色效果，同時作為一種酸味調節劑在飲料產業中發揮重要作用[19-20]，檸檬酸添加量對海棠果果汁飲料品質的影響見圖3。

圖3 檸檬酸添加量對海棠果果汁飲料品質的影響Fig.3 The effects of citric acid addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由圖3 可知，當檸檬酸添加量為0.04 %時，可與白砂糖和果糖形成協調的糖酸比，飲料的感官分值相對更高，不添加或者添加過量都會影響整體的糖酸比，這說明檸檬酸的添加對整體感觀有重大的影響。在其它類型的飲料工藝研究中，如劉雅在蘋果火龍果復合飲料添加了2%的檸檬酸[21]，而吳鵬僅在荸薺果汁中添加0.1%的檸檬酸[22]，由此可知，不同品種的原料，檸檬酸添加量也不同。依照透光率來看，檸檬酸對海棠果汁透光率影響不大，有可能是放置時間較短，檸檬酸在護色效果上在不同組間的優勢不顯著。

2.1.4 β-環糊精添加量對海棠果果汁飲料品質的影響

海棠果原果汁口感較為苦澀，為改善口感，需要對果汁進行脫苦處理，需在果汁中加入β-環糊精，β-環糊精是直鏈淀粉在環糊精葡萄糖基轉移酶作用下生成的一系列環狀低聚糖的總稱，其脫苦機能在于可與苦味物質通過范德華力和氫鍵結合形成穩定的包嵌物，在溶液中十分穩定，可以在不影響果汁的營養成分情況下達到脫苦效果[23]；具有易溶于水，無毒，對熱穩定等優良特性[24]，加上其成本低廉，在食品工業被廣泛應用，β-環糊精添加量對海棠果果汁飲料品質的影響見圖4。

圖4 β-環糊精添加量對海棠果果汁飲料品質的影響Fig.4 The effects of β-cyclodextrin addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由圖4 可知，當β-環糊精添加量為0.2%時，品質較佳，比不添加綜合感官評分高15 分，且對透光率影響不明顯，可能是β-環糊精具有穩定、增溶的特性使得飲料中的微粒被包被，透明度增加[25]。飲料在較短時間內放置，β-環糊精的包埋作用使果汁無懸浮或沉淀現象產生，因此對于最終的透光率影響并不明顯。

2.2 海棠果汁Box-Behnken 響應面結果與分析

Box-Benhnken 響應面優化結果見表3。

表3 海棠果果汁最佳配方響應面試驗設計及結果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental result of Malus rockii Rehd.juice beverage

利用Box-Behnken 響應面對數據進行多元回歸擬合，得到感官分值的二次多項回歸方程為：感官分值Y=89.40+0.92A+0.75B+6.83C+4.00D-0.50AC-0.25 AD-0.25BD+2.00CD-5.33A2-5.33B2-9.45C2-8.20D2

海棠果果汁回歸模型方差分析見表4。

由表4 可知該模型是極顯著的（p＜0.000 1），各單因素中一次項C、D，交互項CD 二次項A2、B2、C2、D2高度顯著的，一次項A 一般顯著，其它均不顯著，檸檬酸對海棠果果汁的感官評價影響最大，其次是β-環糊精，影響最小的是白砂糖，交互項CD 極顯著說明檸檬酸和β-環糊精相互作用對果汁品質有顯著影響，回歸模型的決定系數為R2=0.986 9 說明該模型擬合度良好，可用此模型作為海棠果飲料工藝的分析和預測，該模型失擬項P=0.201 3＞0.05 說明失擬項不顯著，用此模型來表明各因素和響應值的函數關系具有可靠性，各單因素對響應值的影響程度主次順序為：檸檬酸＞β-環糊精＞原果汁添加量＞白砂糖。

表4 海棠果果汁回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of Malus rockii Rehd.juice beverage

檸檬酸和β-環糊精的交互作用的相應面和等高線見圖5 和圖6。

圖5 交互項C 和D 影響海棠果果汁品質的響應面圖Fig.5 Interaction surface C and D affects the response surface of Malus rockii Rehd.juice quality

圖6 交互項C 和D 影響海棠果果汁品質的等高線圖Fig.6 Interaction surface C and D affects the contour map of Malus rockii Rehd.juice quality

由圖5 和圖6 可知，響應面和等高線圖都存在頂點，所選范圍存在極值，等高線形狀為橢圓形，說明檸檬酸和β-環糊精的交互作用顯著，與方差分析結果基本一致。在響應面和等高線在描述檸檬酸和β-環糊精對感官分值的影響時，固定其中一個因素，感官分值隨另外一個自變量的增大呈先增大后減小的趨勢，規律與前期的單因素試驗結果相近。

2.3 海棠果果汁飲料配方的確定

在各因素可選范圍內，以感官分值為響應值，根據模型回歸分析可得海棠果果汁的最佳配方為：原果汁添加量為72.20%，白砂糖添加量8.55%，檸檬酸添加量0.05%，β-環糊精添加量為0.24%，在此優化條件下海棠果果汁的理論綜合分值為90.42 分，同時為驗證該模型的可靠性，根據以上的條件做了3 組重復驗證試驗，所得最終評分為88.0、89.7、88.2，平均分為88.63，與模型預測分值接近，說明此次配方所得的成品在色澤、口感和組織狀態均良好。

2.4 微生物指標測定結果

菌落總數＜100 CFU/mL；大腸菌群＜1 CFU/mL；符合GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》的標準。

3 結論

麗江海棠果原果汁添加量對感官分值和透光率都有顯著的影響，透光率會隨原果汁的增加而下降，果汁中沉淀率會增加，白砂糖、檸檬酸和β-環糊精對果汁的感官有較大的影響，原因在于檸檬酸和白砂糖可與果汁中糖分和可滴定酸形成協調的糖酸比，而β-環糊精則起到脫苦穩定作用。根據Box-Benhnken 響應面優化結果表明海棠果果汁的最佳配方為：原果汁添加量72.20%，白砂糖添加量8.55%，檸檬酸添加量0.05%，β-環糊精添加量0.24%，驗證試驗感官平均分值為88.63，與模型預測值接近，采用此模型配方得到的果汁顏色呈鮮紅色，過夜后果汁依然澄清明亮，無明顯沉淀，酸甜可口，果香味濃郁，同時營養成分得到了較好的保留。在該工藝條件下制得的麗江海棠果果汁飲料酸甜爽滑，改善了海棠果較為苦澀難以入口的問題，為將來麗江海棠果飲料市場和擴大消費人群提供了基礎。