甜米酒酒曲微生物分離和菌種鑒定

蔡海鶯，張婷，沈靈智，彭佩瑩，戴璟，張琪，羅潔，毛克羽，蔡成崗，毛建衛，*

（1.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江科技學院，浙江杭州310023；2.浙江省農業生物資源生化制造協同創新中心，浙江杭州310023）

甜米酒是我國的傳統酒種，歷史悠久，主要以優質糯米為原料，在自然環境中通過微生物混合發酵而成。米酒柔和綿長，香氣宜人，是我國百姓飲食文化中必不可少的部分。我國南方大米產區素有在家釀造獨特風味米酒的傳統[1]。另外，米酒的營養價值同樣引人關注，除原料自身營養成分外，還包含米酒傳統釀制過程中產生的低聚糖、多肽、氨基酸、維生素等易于被人體消化吸收成分[2]。甜米酒雖然功效眾多，但國內甜米酒市場整體呈現產品質量參差不齊，市場規模不大，強勢領導品牌較少，缺乏產品和技術創新等。米酒的釀制為多種微生物混合自然發酵的過程，酒曲為發酵過程中微生物的主要來源。酒曲起源約6000 年以前的中國，最早的文字記載可追溯到1700 多年前北魏賈思勰的《齊民要術》[3]。

我國傳統酒曲的制作受使用原料、空氣溫度和濕度、環境微生物等多種因素的影響，酒曲穩定性很難保證。微生物菌種可謂發酵的靈魂，酒曲中微生物多樣性和數量以及微生物互作等對米酒最終的質量、風味和營養功能都有著重要影響[4-5]。不穩定的酒曲意味著發酵米酒品質和風格也無法穩定，因為利用自然界種類和性質未知的微生物進行發酵，技術流程的標準化難以實現，同時未知菌種還可能帶來食品安全上的風險[6]。因此，獲得安全和穩定性高甜米酒酒曲是發展甜米酒產業化道路的必經之路。隨著科技水平的飛速發展，對酒曲微生物在傳統米酒的發酵過程、微生物功能的認識有了長足的進步，包括酵母酒化、酵母生香、根霉的糖化作用、紅曲霉增強酯化作用以及厭氧異養菌、己酸菌、乳酸菌等的米酒風味形成作用等[7-9]，均表明酒曲微生物對米酒風味和風格的形成以及米酒的功能營養有著重要作用。然而，人們對甜米酒酒曲微生物的分離鑒定和多樣性的研究仍然較少。

本研究鑒于甜米酒酒曲微生物對米酒發酵過程、功能性、風味和生物安全性等的潛在影響，通過收集來源不同的酒曲樣品，進行細菌和真菌微生物的分離、形態學觀察和分子生物學鑒定，對酒曲微生物進行多樣性分析，為甜米酒釀制提供了生物資源的選擇依據和參考，同時有利于對揭示米酒微生物的作用機制和提高米酒的品質、穩定性等方面具有重要理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲分別源于孝感、蘇州、麗水、南寧、黔東、達州、阜陽、岳陽和紹興等地，編號見表1。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；DHG-9240A 鼓風干燥箱、BPH-9162 恒溫培養箱：上?；厶﹥x器制造有限公司；LDZF-30KB 滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；DYY-6C 電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Mastercycler pro 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：艾本德中國有限公司；Bio-rad Gel Doc XR+凝膠成像分析系統：美國伯樂公司。

表1 米酒酒曲編號及來源Table 1 Sources and codes of Chinese sweet rice wine starters

細菌基因組DNA 提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 培養基的配制

魯里亞貝塔尼（luria-bertani，LB）細菌培養基：0.5 %酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉，蒸餾水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。固體LB 培養基：LB 細菌培養基添加1.5%瓊脂粉。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，蒸餾水1 L，pH6.0，115 ℃濕熱滅菌20 min。固體培養基：對應培養基中添加1.5%瓊脂粉。

1.4 酒曲微生物的分離純化

細菌和真菌的分離和培養[10]：取12 種酒曲每種樣品1 g，分別溶解于10 mL 滅菌生理鹽水中，依據樣品菌含量調整稀釋倍數，取終濃度是10-3、10-4、10-5g/mL 和10-6g/mL 的酒曲樣品溶液0.1 mL，均勻涂布于LB 和YPD 培養基（YPD 含終濃度0.1 mg/L 四環素和鏈霉素）培養皿上，分別用于細菌和真菌微生物的分離和培養。將涂布好的LB 和YPD 培養基培養皿，分別置于37 ℃和28 ℃，細菌培養1 d~2 d，真菌培養2 d~4 d。挑取培養皿上長出的單菌落，轉移到相對應的新LB 和YPD 培養皿中分離純化培養，分離的單菌落轉移到LB 和YPD 液體培養基，分別在37 ℃和28 ℃，200 r/min 搖床培養16 h 和24 h，直到培養液完全渾濁。

1.5 細菌和真菌菌株的分子生物學鑒定

細菌菌種DNA 提取采用細菌基因組DNA 提取試劑盒。細菌采用16S rRNA 基因片段進行分子生物學鑒定。細菌菌株16S rDNA 序列擴增：16S rRNA 基因片段擴增采用通用引物27F 和1492R[11]：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 擴增以菌株提取的細菌基因組DNA 為模板，PCR 反應體系（50 μL）條件：正向和反向引物各2 μL、模板DNA 1 μL、高保真DNA 聚合酶KOD 2 μL、10 倍酶緩沖液5 μL 和超純水38 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復性0.5 min，72 ℃延伸1min，30 個循環；72 ℃末端補齊延伸10 min。

真菌菌種DNA 提取采用酵母基因組DNA 提取試劑盒。真菌采用rRNA 基因ITS 序列片段進行分子生物學鑒定。ITS 擴增引物為ITS1 和ITS4[12]：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 擴增體系和反應程序同細菌16S rRNA 片段PCR 擴增。PCR 擴增效率用1%的瓊脂糖凝膠電泳確認，將目的片段送至江蘇金維智生物技術有限公司測序。

1.6 微生物多樣性系統發育分析

測序結果用于微生物多樣性分析和系統發育樹構建。將菌株DNA 擴增片段序列上傳至NCBI 數據庫在線軟件BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），獲得與目的菌株片段序列相似性較高的細菌16S rRNA和真菌ITS 基因序列。進一步用MEGA7 軟件構建系統發育樹，分析分離菌株的種屬及其的系統發育關系。

2 結果與分析

2.1 細菌和真菌分離和形態觀察

米酒的品質、風味、安全性和生產效率與酒曲中微生物有重要關系。本研究從12 種酒曲中分離到46株細菌和54 株真菌，編號分別為細菌bM-N 和真菌M-N（M 分別為12 種酒曲樣品編號1~12，N 分別為同一樣品中微生物序號）。甜米酒細菌和真菌分離種類統計見表2。

表2 甜米酒細菌和真菌分離種類統計Table 2 Numbers of bacterialand fungal species isolated from Chinese sweet rice wine

酒曲微生物的分離鑒定結果表明，從12 種不同來源的酒曲分離到46 株細菌和54 株真菌。不同來源的酒曲微生物種類數量有較大差異，NN5 酒曲分離到14種微生物，BY9 和SS12 也分離到10 種微生物，而XG2 和XG1 僅分別分離到4 種和5 種。根據培養基來源、菌落形態和細胞形態觀察，分離的真菌中以酵母為主，少量絲狀真菌，表明甜米酒中的酒精主要來源于酵母。另外，分離得到的細菌種類與真菌種類接近，表明細菌也在甜米酒釀制過程中起重要作用，和絲狀真菌一樣，部分細菌分泌淀粉水解酶系分解淀粉生成葡萄糖，另外，細菌在該微生態體系中代謝所產生的酸、酯、醇、酮等物質對米酒的風味形成意義重大。然而，酒曲中菌株種類的多少和微生物總數量并無直接關系，微生物總數量主要由種群中優勢菌種的數量決定，從菌落微生物計數結果表明，XG1、XG2、SS11 和SS12 有較高的菌數[4]。不同微生物種類和組成構成的微生物菌群，通過共生、競爭和拮抗等相互關系調節米酒釀制過程中的微生態，從而改變了米酒最終的產品品質和風味[13-14]。米酒酒曲微生物的鑒定工作由來已久，最初由于條件的限制，對米酒中微生物的認識僅限于能夠在實驗室條件下能分離培養的微生物，如李健容等[9]從酒曲中分離了3 類酵母菌（酒香酵母屬、假絲酵母屬和畢赤酵母屬）和2 類根霉菌（米根霉和華根霉）；研究者還從米酒酒曲中篩選了功能性的微生物，如產γ-氨基丁酸的多種微生物[15]，產凝乳酶的微生物菌株[16]等。隨著生物組學的發展，對米酒釀制過程中的微生物的認識也更加深入[17-19]，這類米酒生物多樣性的研究也為米酒微生物的分離提供了參考。

2.2 細菌和真菌分子生物學鑒定

傳統發酵食品是篩選微生物資源的重要來源。通過分子生物學特征基因片段的序列比對，結合形態學觀察，是目前常用的快速菌種鑒定手段。本研究選擇篩選到的46 株細菌和16 株長勢良好的酵母形態和絲狀真菌的真菌，對其基因組DNA 進行PCR 擴增。細菌16S rRNA 基因V3~V4 區擴增結果見圖1。

圖1 細菌16S rRNA 基因片段PCR 擴增電泳結果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of bacterial 16S rRNA gene fragment

由圖1 可知，僅少量菌株沒有明顯目的條帶，其余41 個樣品PCR 擴增均獲得約1.5 kb 大小的目的片段，用于目的基因測序。然而，與細菌不同，真菌中獲得目的基因ITS 序列的PCR 擴增條帶的很少，并且擴增條帶大小有一定差異，在約0.75 kb 到1.5 kb 之間。其中，2 株擴增條帶明顯，14 株顯示有少量擴增。表明真菌在DNA 提取和PCR 擴增效率較細菌明顯偏低，可能受到細胞壁破碎難度較大和真菌自身次級代謝產物的影響。對41 株細菌和16 株真菌PCR 擴增產物進行測序，獲得了細菌16S rRNA 基因V3~V4 區和真菌18S rRNA 基因ITS 序列。

2.3 進化樹和多樣性分析

DNA 測序結果經BLAST 在線軟件比對，并用MEGA7 軟件構建了酒曲中細菌和真菌的系統發育樹。酒曲中分離的芽孢桿菌菌株系統發育樹和其他細菌菌株系統發育樹見圖2 和圖3。

酒曲微生物中存在大量芽孢桿菌屬（Bacillus），鑒定出的細菌中有8 株與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis） 同源關系最近，10 株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源關系最近，3 株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源關系最近，2 株（b7-2 和b7-3）與萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）同源關系最近，b4 -3 與地衣形芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源關系最近，1 株（b4-4）與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）同源關系最近，還有2 株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有一定的同源性，還有5 株僅能鑒別到芽孢桿菌屬（Bacillus）。酒曲的制作通常是通過淀粉含量較高的食品為固體原料（如小麥粉和米飯等），在有氧條件微生物自然發酵而成。酒曲從有氧環境富集微生物的這一特性導致酒曲微生物中含有大量芽孢桿菌。然而芽孢桿菌在米酒的釀制過程中可提供少量淀粉酶和風味物質前體，在后期酒精濃度較高時生長受到抑制，乳酸菌的含量會相對較高[4]。蠟樣芽孢桿菌是常見的腐敗菌，趙東在研究西藏青稞酒酒曲微生物多樣性也鑒定出該菌種[20]。除芽孢桿菌外，酒曲微生物中還分離到溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、阪崎氏腸桿菌（Cronobacter sakazakii）、埃希氏菌屬（Escherichia）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）等的同源微生物，其中溶血性葡萄球菌和肺炎克雷伯菌等均為一定能力的條件致病菌。這一發現表明酒曲的制作需要嚴格的管理規范和制作工藝，防止米酒的發酵過程中引入致病菌和腐敗菌，引起食品生物安全性的風險。酒曲中分離的真菌微生物菌株系統發育樹見圖4。

圖2 酒曲中分離的芽孢桿菌菌株系統發育樹Fig.2 Phylogentic tree of Bacillus isolated from CSRW starters

圖3 酒曲中分離的其他細菌菌株系統發育樹Fig.3 Phylogentic tree of other bacteria isolated from CSRW starters

圖4 酒曲中分離的真菌微生物菌株系統發育樹Fig.4 Phylogentic tree of fungi isolated from CSRW starters

米酒中有豐富的真菌微生物資源。除典型的產酒精微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），還發現其他產酒精微生物，如庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和米根霉（Rhizopus oryzae）等[21]。另外，扣囊復膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）等非酒精酵母也出現在酒曲微生物中。有報到表明扣囊復膜酵母菌可通過與釀酒酵母的互作和共生影響乙醇的產量，并改變發酵液中風味物質的生成[22-23]，未來對于非釀酒酵母與釀酒酵母之間的互作機理研究，有望對改善和調節酒精發酵飲品提供理論指導。另外，酒曲真菌微生物試驗的還鑒定了卷枝毛霉（Mucor circinelloides）和印度毛霉菌（Mucor indicus）的存在。

3 結論

本研究對12 種來源的酒曲進行了微生物的分離鑒定，篩選到的46 株細菌和54 株真菌微生物，結合菌落形態和細胞形態，進一步通過分子生物學鑒定快速鑒定了其中41 株細菌和16 株真菌微生物。酒曲細菌微生物中含有大量芽孢桿菌；另外，酒曲中還鑒定到少量病原菌和腐敗菌，說明部分中國傳統發酵食品還有一定的生物安全隱患，需要不斷創新、轉型升級才能迎來發酵食品的工業現代化。酒曲中還有很多真菌微生物資源，通過分離純化的微生物資源可用于甜米酒酒曲制作和米酒釀制，也可以用于其中發酵食品的研究開發。經過鑒定的分離微生物的利用，往往可改善發酵食品的品質和風味；同時，科學的微生物搭配可改善發酵食品的原料利用效率，還減少了病原菌和腐敗菌對食品安全性的潛在威脅，是未來發酵食品發酵劑的研究方向之一。