水稻氮高效利用相關基因的研究進展與展望

鄭興飛 胡建林 董華林 王紅波 查中萍 殷得所 周黎 徐得澤

摘要 隨著人口的不斷增加以及生態系統的逐漸惡化，糧食安全問題成了近年來討論的熱點。糧食作物的穩產高產優質是育種家的重要育種目標。在我國，由于農業結構的不合理以及栽培模式的落后，使得糧食安全問題更加嚴峻。水稻是最重要的糧食作物之一，確保水稻的持續高產是保障糧食安全的關鍵。氮是影響植物生長發育的重要礦質元素，過少或過多施用氮肥均會造成作物的減產。因此，對水稻氮素吸收、利用與分配進行深入研究，有利推進化肥施用的精細調控，是實現現代生態農業研究的幾個必須課題。綜述了水稻氮高效相關基因的研究進展，以期為水稻氮高效育種利用提供參考。

關鍵詞 水稻;氮素;基因;分子機理

中圖分類號 S511文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）24-0001-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.001

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Research Progress and Prospect of Genes Related to Nitrogen Efficient Utilization in Rice

ZHENG Xingfei，HU Jianlin，DONG Hualin et al （Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement，Food Crops Institute，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430064）

Abstract With the continuous increase of population and the gradual deterioration of ecosystems，the issue of food security has become a hot topic in recent years.In China，the problem of food security is more serious due to the irrational agricultural structure，backward cultivation models，and large agricultural inputs and low output.Rice is one of the most important food crops.To ensure the sustainable high yield of rice is the key to ensure food security.Nitrogen is an essential element that affects plant growth and development.Too little or too much application of nitrogen fertilizer would reduce crop yield.The following are several necessary topics for the realization of modernization of ecoagriculture： indepth research on rice nitrogen absorption，utilization and distribution and the finetuning of fertilizer application and improve yield and quality of crops.We reviewed the research progress of nitrogen efficiency related genes，aiming at providing references for nitrogen efficiency utilization breeding in rice.

Key words Rice;Nitrogen;Gene;Molecular mechanisms

基金項目 國家重點研發計劃（2016YFD0102103，2018YFD0100806）;糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室開放課題（2018lzjj02，2018lzjj03）;湖北省農業科技創新中心資助項目（2016-620-000-001-005）。

氮（N）素是植物生長發育所需的必需元素之一，也是植物從土壤中吸收最多的元素。氮素構成了植物生長發育所必需的物質，包括蛋白質、氨基酸和激素等。這些物質參與了植物體內一系列的生理代謝調控，控制植物的各種生命活動以及產量構成。目前在我國，由于氮肥的不合理施用導致環境污染問題日益嚴重[1]。氮肥的過多施用會出現以下幾個主要問題：首先，導致土壤中水勢下降，造成植物水分吸收困難，葉片萎蔫，在籽粒充實期過多施用氮肥，甚至會導致籽粒吸水不足，造成癟粒;其次，會產生氣體毒害，破壞臭氧層;另外，還可導致水質富營養化等環節污染問題。在我國，氮肥的施用量已平均達到了180 kg/hm2，然而氮素的利用率卻只有28%～35%，比全球氮素平均利用水平低15%～20%[1-2]。根據《中國統計年鑒》1980—2014年，我國的氮肥施用量增長了近3倍，而糧食的總產量僅增加了83%。研究水稻氮素吸收、轉運、分配的分子機理，可以從合理、科學施肥和培育高效氮素利用品種等方面來改良目前的農業種植模式。同時，減少氮肥施用，提高氮素利用率，減輕環境污染，減少農業成本也是現在重要的育種目標之一[3-4]。

植物能夠利用的氮素主要有NH4+ 和 NO3-2種。目前，關于植物氮素高效利用的研究主要集中在根系對環境中氮素的吸收能力上[5]。在模式植物擬南芥中，利用突變體材料鑒定出一系列轉運NH4+的AtAMT的基因和轉運NO3-的AtNRT基因，并對這些基因與NH4+和NO3-的親和能力進行了一系列的研究[6-7]。而在水稻中，由于表型鑒定困難，利用正向遺傳學的手段僅鑒定出少量氮素吸收相關基因。鑒于此，筆者在總結水稻氮素吸收利用的特點的基礎上，對水稻氮素利用相關基因研究進行總結展望。

1 水稻氮素吸收特點

植物對氮素的利用包括以下幾個主要步驟：吸收、同化和運輸等。當葉片進入衰老期后，同時還伴隨著氮素的循環和再分配。目前，在模式植物擬南芥和水稻中，研究比較深入的是氮素的吸收和同化，這2個步驟也決定了植物從外界攝取氮素的能力，是植物氮素利用率的關鍵限制因子。在土壤中，NH4+和NO3-的分布隨著土壤環境的變化而變動，其中最大的影響因素是土壤的pH[8]。因此，植物在長期的演化過程中，對土壤pH的適應性決定了其在特定條件下偏好吸收的氮素類型。一般而言，適應偏酸性、還原性土壤的植物偏好吸收NH4+，而適應偏堿性土壤的植物偏好吸收NO3-[9]。因此，在不同的土壤條件下，施用不同類型的氮肥也有利于提高植物的利用率。

關于水稻氮素吸收的研究，Kronzucker等[10]利用13N同位素示蹤法研究銨態氮和硝態氮吸收規律，結果發現水稻對硝態氮的吸收大于銨態氮。何文壽等[11]研究發現，從水稻移栽到開始分蘗，銨的吸收比例為53.5%，分蘗期吸收比例為71.8%，拔節期到乳熟期銨態氮與硝態氮吸收量基本一致，在蠟熟期吸收比例為57.6%。Yoneyama等[8]利用同位素示蹤法對水稻全生育期（約150 d）氮素吸收與分配情況進行了系統的研究。結果表明，營養生長到籽粒充實階段葉片生長、分蘗形成、根系伸長和小穗的分化等階段所需的氮源中，有50%來源于成熟的器官;這些成熟的器官在衰老階段將氮源以蛋白質、氨基酸或含氮化合物的形式，通過韌皮部篩管運輸到正在生長的組織，以實現氮素的流轉;另外一半的氮素來源于根系從土壤中吸收的無機氮源，通過同化作用之后，由木質部導管向上運輸;在水稻的籽粒充實階段，約80%的氮源來自于成熟器官的氮素轉運。

抽穗期是水稻根系各指標的轉折點，抽穗后水稻的根系生長緩慢、根系活力開始下降。生育后期，高的氮素供應有利于維持根系活力、延緩根系衰老[12]。董桂春等[13]對不同抽穗期的水稻品種進行了氮素吸收利用研究發現，生育期長的品種吸氮能力強，并且促進營養器官中氮素向穗部運轉，降低莖葉中氮素分配比例，有利于生育期長的品種氮素利用效率的提高。一些研究表明，全生育期較短的品種氮素籽粒生產效率較大[14]，生育期較長的品種成熟期吸氮量較大[15-17]?？梢?，品種生育期的長短與水稻氮素吸收利用有密切的關系，生育期不同的品種氮素吸收規律具有明顯的差異。葉利庭等[18]通過15N同位素標記，發現不同基因型水稻的氮積累量在齊穗期沒有差異，而在成熟期氮高效利用基因型在氮積累量具有優勢。晏娟等[19]研究發現，增加施氮量提高了莖葉中15N的分配比例，但降低了15N在水稻籽粒中的分配比例，而在根中的分配比例不受施氮量和品種的影響。近年來，有關氮素在水稻不同器官的分配和轉運的動態變化已有不少研究，且已明確這些特征與產量的關系，認為產量的高低與生育后期營養器官中的氮素向經濟器官的轉運量有關。

2 水稻對銨態氮吸收與同化的分子機制

在土壤中，硝態氮和銨態氮的含量隨著土壤環境的變化而變化，因此植物進化出針對不同氮源的2種吸收機制，這2種吸收機制保證了作物在不同環境下能夠感知土壤中氮素的狀態，從而響應環境的變化，調整自身的吸收能力。目前，對植物吸收分子機制方面的研究，主要集中在模式植物擬南芥上，利用突變體材料，鑒定出了一系列植物銨轉運蛋白（Ammonium transporter，AtAMT） 家族成員，他們大多在根系中表達，并且定位于質膜，負責銨離子的高親和吸收[6]。

近年來，利用基因工程和正向遺傳學方法，在水稻中共鑒定到10個OsAMT基因，根據同源性的不同將其分為4類，3個OsAMT1、3個OsAMT2、3個OsAMT3和1個OsAMT4[20]。Sonoda等[21]利用同源比對的方法，克隆到水稻中與AtAMT同源的3條序列，分別命名為OsATM1∶1、OsATM1∶2和OsATM1∶3。在氮素吸收缺陷型酵母31019b表達這3個基因，發現均能增強該突變體對氮素的吸收，結合OsATM1∶1，OsATM1∶2，OsATM1∶3的轉錄水平能夠受到銨態氮高效誘導，確認這3個基因屬于水稻OsAMT家族成員。Suenaga等[20]利用酵母突變體鑒定出OsAMT2.1具有NH4+轉運蛋白的功能，同時研究表明，該基因在水稻的根系、莖中組成型表達，與介質無機氮無關;而OsAMT3.1表達相對較弱。因此推測，在與水稻NH4+吸收相關基因調控中，主要以OsAMT1家族為主，其余的形成1個小家族。此外，眾多學者在水稻中用15N標記的銨態氮浸泡培養水稻，以觀察根系對銨態氮吸收和同化作用。研究表明，水稻根系通過OsAMT蛋白將NH4+轉移到胞質中，首先快速積累的是15N標記的谷氨酰胺，這個過程是在谷氨酰胺合成酶1（GS1）的催化作用下完成，稱為NH4+的同化[22]。谷氨酰胺被轉運到質體中，通過GS-GOGAT途徑（依賴鐵氧還蛋白的谷氨酸合成酶Fd-GOGAT或者依賴NADH的谷氨酸合成酶NADH-GOGAT）轉化成為谷氨酸[23]。此外，15N標記天冬酰胺的含量逐漸積累，推測是由于谷氨酰胺含量的增加，在依賴谷氨酰胺的天冬酰胺合成酶1（OsAS1）的催化作用下合成天冬酰胺[24]。完成NH4+的同化之后，氮素以谷氨酰胺或者其他氨基酸的形式由木質部向地上部分運輸[8]。

3 水稻對硝態氮吸收與同化的分子機制

在水稻根系中存在著高親和力和低親和力2種不同的硝態氮吸收方式。當土壤中硝態氮含量較低時，植物啟動高親和硝態氮吸收機制;而當土壤中硝態氮含量較高時，則以低親和硝態氮吸收機制為主，以維持植物體內硝態氮的平衡。水稻硝態氮高親和轉運是由NTR2基因家族編碼，與擬南芥中的AtNTR2高度同源。硝態氮低親和力轉運子由NTR1基因家族編碼，與擬南芥NTR1蛋白同源[25]。用15N標記的硝態氮培養水稻，在根系中能夠陸續檢測到15N標記的NH4+、谷氨酰胺和谷氨酸等，研究表明，水稻根系通過OsNTR蛋白將NO3-轉移到胞質中，大部分的NO3-被還原成NH4+，然后經由GS-GOGAT途徑同化為谷氨酸，小部分的NO3-被依賴NADH的硝酸根還原酶（NADH-NR）還原成為NO2-，然后運輸至質體中，在依賴鐵氧還蛋白亞硝酸鹽還原酶（Fd-NiR）的作用下生成NH3。NH3在谷氨酰胺合成酶2（GS2）的作用下同化成為谷氨酰胺，然后由Fd-GOGAT途徑生成谷氨酸，然后轉運到木質部[23]。

由此也能看出，植物對硝態氮的同化過程要比銨態氮更為復雜，需要消耗更多的能量，水稻對銨態氮的利用效率也高于硝態氮，因此被認為是喜銨作物。此外，Yoneyama等[8]發現，由銨態氮同化產生的氨基酸大多運輸至生長旺盛的葉片，而由硝態氮同化產生的氨基酸則運輸至成熟的葉片中。同時，AMT和NRT的轉錄水平能受到IDD、NLP和HY5等轉錄因子的調控，AMT和NRT蛋白能夠通過磷酸化修飾來調節根系對氮素的吸收能力[26]。為了嚴格控制根系的氮素吸收能力，銨態氮、硝態氮轉運蛋白在各個層面上都受到嚴格的調控[27]。

4 反向遺傳學克隆氮素吸收關鍵基因

盡管水稻氮素吸收與轉運的基因被定位，但這些基因多是基于擬南芥相關同源基因序列克隆獲得。由此鑒定的氮素相關基因盡管重要，但也相對保守，很難在水稻中直接進行育種利用。從2001年農業部948計劃“參與全球水稻分子育種計劃”項目開始，張啟發院士等逐步提出“綠色超級稻”的育種概念，其中重要目標就是提高水稻肥料利用效率。

隨著水稻轉基因技術和基因編輯技術的應用，越來越多的氮素吸收相關基因在水稻中的功能得到了有效的鑒定，為水稻的氮素高效育種提供了基因資源和種質資源。2012年，Yan等[28]發現將水稻中的OsNAR2.1用RNAi的技術沉默之后，轉基因植株中和硝態氮轉運相關的基因OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a表達量均下調，在施用相同含量硝態氮的情況下，轉基因水稻比對照材料生長勢弱，對硝態氮的吸收能力下降。OsNAR2.1干涉之后不影響轉基因材料對銨態氮的吸收[28]。OsNAR2.1是OsNRT2家族成員（OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3a）的伴侶蛋白，OsNAR2.1和OsNRT2形成的復合體是水稻中硝態氮高親和里轉運子[9]。因此，提高水稻體內OsNAR2.1的表達水平能夠增強水稻對硝態氮的吸收能力，同時也可以開發相關的標記，作為水稻氮高效利用材料的篩選標記。

目前，利用反向遺傳學的方法在水稻根系中鑒定到了一些氮素吸收的相關基因，但是氮素如何從根系向地上部分轉移，哪些蛋白參與了氮素的轉移仍然不清楚。有研究表明，OsNRT2.3存在可變剪切，編碼2種不同的蛋白產物OsNRT2.3a和OsNRT2.3b[28]。Tang等[29]發現OsNRT2.3a定位于根部木質部中柱薄壁細胞的質膜上，且在根系中高量表達;原位雜交及組織表達模式分析表明，OsNRT2.3b主要在葉片的韌皮部表達。將水稻中的OsNRT2.3a用RNAi的技術沉默之后，轉基因植株根系中的氮素含量增加，莖稈中氮素含量減少，但是整個植株的總氮含量并沒有明顯的變化，說明OsNRT2.3a參與了氮素從根系向地上部分的轉運，但不影響植物對氮素的吸收。

雖然，利用反向遺傳學的手段進行基因功能的分析存在一些局限性，其一般只研究單個或者少數基因的功能。但是不可否認，反向遺傳學的手段給功能基因組學的研究帶來了很大的便利，能夠快速錨定其在作物中的候選基因并進行功能驗證，也有利于進行分子調控網絡的研究，結合現在成熟的轉錄組、蛋白組、代謝組、表觀遺傳學的研究手段，可進一步解析基因之間復雜的調控網絡，為植物育種提供更多的候選基因和種質資源[30-31]。

48卷24期 鄭興飛等 水稻氮高效利用相關基因的研究進展與展望

5 正向遺傳學挖掘氮素吸收關鍵基因

栽培稻主要包括秈稻和粳稻2個亞種。已有研究表明，相對秈稻而言，粳稻對氮肥的利用率低，對氮肥供應敏感，且產量與氮肥供應有顯著的相關性，這意味著粳稻種植需要更多的肥料施用，農業成本更高[32]。秈粳稻之間對氮素利用效率差異的分子機制一直鮮見報道[33]。

2014年，中國科學院遺傳與發育生物學研究所傅向東實驗室構建了粳稻QZL2（Qianzhonglang 2）×秈稻NJ6（Nanjing 6）的重組自交系，其中RIL-D22這個株系表現為氮素敏感，RIL-D04表現為氮素不敏感。以RIL-D22作為供體，QZL2作為輪回親本，構建了BC2F5群體，圖位克隆得到1個控制氮素高效利用的數量性狀基因QTL-qNGR9，并定位在第9號染色體上。進一步研究發現，該基因編碼的是1個異源三聚體G蛋白的γ亞基，含有硝態氮高效利用等位變異qNGR9的水稻生長對增加氮素供應不敏感，表現為半矮化。相同的施氮條件下，近等基因系NIL-qNGR9的籽粒產量明顯高于NIL-qNGR9，這意味著要達到相同的產量，NIL-qNGR9必須施用更多的氮肥，而NIL-qNGR9由于氮肥利用效率高，需要較少的氮肥[32]。該研究不僅在理論上證明了G蛋白能夠參與植物對氮素的利用，而且為水稻高效氮素利用育種提供了優良的基因資源。

2015年，中國科學院遺傳與發育生物學研究所儲成才團隊對34個秈稻和粳稻品種的氮肥利用率進行了研究，發現秈稻對硝態氮的利用率明顯高于粳稻，而對銨態氮的利用率與粳稻沒有明顯差異。為了研究秈稻和粳稻對氮素吸收的遺傳差異，首先氯酸鹽模擬硝酸鹽毒害，研究了134個水稻品種對氯酸鹽的敏感性，發現秈稻比粳稻對氯酸鹽處理更加敏感。進一步以對氯酸鹽高度敏感秈稻品種IR24作為供體，對氯酸鹽低敏感的粳稻品種日本晴作為受體，構建了BC2F5群體，共315個株系。對這315個株系進行氯酸鹽敏感性試驗，結果顯示有7個株系表現為對氯酸鹽的高度敏感，其中對氯酸鹽最敏感的株系NI10-1在第10號染色體上插入了來自IR24的染色體片段，從而表現出相對受體材料（日本晴）而言，更高的氯酸鹽敏感性和硝態氮吸收能力。將NI10-1和日本晴進行雜交，F2代材料氯酸鹽敏感性表現出1∶2∶1 的分離情況，推測該插入片表現為半顯性。進一步精確差異區段，最終將候選基因定位在了第10號染色M10-21和M10-23共2個遺傳標記之間，并且這2個標記之間只有1個編碼基因序列—NRT1.1B （OsNPF6.5）。日本晴和IR24的NRT1.1B基因編碼序列存在2個SNP位點，其中的1個產生的是同義突變，另外1個導致蘇氨酸（日本晴）突變成甲硫氨酸（IR24），在其他秈稻、粳稻品種中也發現了該SNP的存在，證實了秈粳稻間的硝態氮吸收差異是由于NRT1.1B的秈粳稻中等位基因的差異造成的，轉化來源于IR24的NRT1.1B的轉基因水稻也能夠提高水稻對氮素的利用效率[34]。NRT1.1B基因的發現為遺傳改良提升我國粳稻氮素利用效率提供了理論基礎和優異的基因資源[35]。2018年，左建儒團隊圖位克隆了1個控制水稻氮素利用效率的關鍵基因ARE1，該基因產物定位于葉綠體，在氮素限制條件下，ARE1突變體可以增強氮素利用效率，其啟動子區的插入突變，導致ARE1表達量降低，水稻籽粒產量增加，該基因為培育氮高效利用水稻提供了重要基因資源[36]。

綜上可知，正向遺傳學是一個相對耗時且工作量大的研究方法，但是正向遺傳學定位出來的基因能夠快速應用于育種和生產實踐，且效應明顯。隨著高通量測序技術的發展以及測序成本的不斷降低，多種簡單快捷的利用測序手段定位基因的方法被開發出來。高通量測序技術結合正向遺傳學將成為從表型到基因到育種實踐最有效的手段。

6 問題與展望

氮素在植物生長發育以及產量形成中都是不可替代的元素，過多或過少使用氮肥都會造成經濟損失，提高植物對氮素的利用效率，減少氮肥的施用量，可以減少農業成本，控制環境污染，保證糧食安全。提高水稻對氮素的利用效率不僅包括氮素的吸收，還包括氮素的運輸以及庫源之間的分配問題，如何使更多的能量從環境流入到庫中，實現水稻產量的增加，才是真正需要解決的科學問題。目前，水稻高效氮素利用機理研究雖然取得了一定的進展，但是仍然處于起步階段，還停留在研究水稻根系如何從土壤中吸收氮素。而這些與氮素吸收、轉運、分配相關的因子又是如何感知氮素含量的變化、受到哪些因子的調控仍然未知，還需要科研工作者進一步挖掘和研究。

隨著各類組學的發展，進一步結合新的技術手段，研究水稻對氮素吸收利用，從轉錄水平、蛋白水平、代謝水平，甚至表觀水平系統地研究水稻氮素的各個層面，提高水稻對氮素的利用效率。此外，在水稻品種高產高效遺傳改良的基礎上，要進一步結合精確的大田管理栽培技術，最大限度地發揮品種的生物學潛能，實現環境友好、高產、高效的“綠色超級稻”目標。

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