楊陽,李祥松,郭倩
(1.大同大學生物科學學院,山西大同 037009;2.北京索萊寶科技有限公司,北京 101102)
刺梨是我國貴州省等地的特產薔薇科植物,其果實成熟后散發出濃烈的香味,外形多數為橢圓球狀,表面長有很多類似仙人掌外殼的小刺,故被稱為“刺梨”[1]。刺梨富含多維生素P(蘆?。┖蚐OD(超氧化物歧化酶),含量遠超其它水果,是世界上已知水果中含量最高的品種[2]。蘆丁又稱蕓香苷、維生素P,屬于維生素類藥,有研究證明蘆丁是提高心腦血管疾病治療效果的關鍵[3]。
本實驗通過堿提取、酸沉淀法提取刺梨中的蘆丁,有效測定其蘆丁含量,并選用3種菌進行抑菌實驗,為刺梨的應用、蘆丁新資源的開發以及抗菌藥物的研發提供一定的參考。
材料:刺梨干果(產地:貴州),蘆丁對照品(江西佰草源生物科技有限公司),飽和石灰水、濃鹽酸12 mol/L、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(分析純)、乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)均來自鑫順源科貿有限公司。水(重蒸水)、瓊脂、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉均來自北京索萊寶科技有限公司。大腸埃希氏菌(ATCC8739)(青島綠谷有限公司)、金黃色葡萄球菌(CMCC26003)(招遠拓普生物工程有限公司)、枯草芽孢桿菌(CMCC63501)(招遠拓普生物工程有限公司)。
儀器:UV725紫外-可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司),100SD超聲波清洗器(深圳市超潔科技實業有限公司),SHB-IIIA循環水式多用真空泵(長沙明杰儀器有限公司),TopPette移液槍(濟南來寶醫療器械有限公司),DH-600AS電熱恒溫培養箱(北京市恒諾利興科技公司),JM-B電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司),YXQ-30SII高壓滅菌鍋(上海博訊醫療生物儀器有限公司)。
1.2.1 蘆丁的提取與精制
實驗采用堿提取、酸沉淀法提取與精制蘆丁。稱取刺梨3g,在乳缽中研磨至粉末狀,放于100 mL燒杯中,加入30 mL飽和石灰水(以棉花過濾至澄清),調節pH至7~8,期間不斷攪拌,加熱煮沸15 min,趁熱以棉花過濾(過濾前應將棉花用水充分潤濕,趕出其中的氣泡)。向殘余物中添加飽和石灰水至pH為7~8,在煮沸條件下攪拌10 min,趁熱過濾,防止Ca(OH)2析出使液體變渾濁。將兩次得到的濾液混合、放冷。向冷卻后的濾液中緩慢添加濃鹽酸,并用玻璃棒攪拌,調節pH至3~4,放置24h以上后倒出上清液,將剩下的溶液殘渣抽濾,并用蒸餾水將其pH洗至5~6。此法操作簡單,適合工業大量生產,但實驗過程中要控制好pH,防止因提取過程中蘆丁溶解不足或再次溶解,影響蘆丁的提取率[4]。
對粗提取物進行二次提取,加入30 mL的重蒸水進行加熱,加入飽和石灰水使得pH調節至8~9,使蘆丁充分溶解,趁熱過濾,防止Ca(OH)2析出使液體變渾濁。使濾液自然冷卻,向濾液中加鹽酸調節pH至4~5后靜置,抽濾沉淀,再用蒸餾水將其pH洗至5~6。
1.2.2 蘆丁含量測定
1.2.2.1 對照品溶液的制備
稱取蘆丁對照品20 mg,用60%的乙醇溶液超聲處理使其溶解,配制成濃度為0.2 mg/mL的標準貯備液。
1.2.2.2 標準液的制備
如表1所示,配置5個濃度標準溶液和1個空白溶液。添加試劑后,用30%乙醇溶液定容至25 mL,混合均勻,靜置6 min,用紫外分光光度計在510nm處測定吸光度值。
表1 不同濃度標準品的制備
1.2.2.3 樣品測定
移液管量取濃度為0.2 mg/mL(標示濃度)的蘆丁提取液5.0mL,按照標準曲線的制備方法同樣置于25 mL容量瓶中,依次添加試劑,最后在510 nm波長下測定吸光度值。蘆丁含量的計算方法為:
1.2.2.4 樣品穩定性實驗
將蘆丁待測液每間隔1 h測量一次吸光度值并記錄,共測量5次。期間要注意常溫保存,并避免陽光直接照射
1.2.3 抑菌實驗(紙片擴散法)
1.2.3.1 抑菌藥液的制備
用無菌水將蘆丁提取物分別配制成5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL和40 mg/mL的溶液,放置備用。
1.2.3.2 接種和紙片貼放
準備好固體培養基,分別稱取胰蛋白10g、酵母提取物5g和NaCl 10g,置于燒杯中;加入800ml蒸餾水于燒杯中,用玻璃棒攪拌,使藥品全部溶化;用1MNaOH調PH至7.2;將溶液倒入量筒中,加入15 g瓊脂粉,補加蒸餾水1L;高壓蒸汽滅菌20 min;待培養基溫度降至50℃時,在超凈臺上加入所需抗生素,搖勻;鋪板,90 mm直徑的培養皿約需20 ml培養基;待培養凝固(約10分鐘后),將平板倒置,4 ℃保存,使用移液槍吸取各配置好的菌懸液0.05 ml分別加入培養基,進行平板涂布后,靜置待表面干燥后待用,一定要注意對涂布器進行酒精燈滅菌,避免菌種之間感染。
用打孔器準備直徑為8 mm的濾紙片,每個接種過的平板貼放5個同等大小的紙片。將紙片放入不同質量濃度(5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L)的藥液中,使其完全浸濕,之后貼放于平板表面,做好記號,紙片與紙片、紙片與平板邊緣之間要保持20 mm以上的距離,避免影響測量結果,以無菌水浸濕的紙片為陰性對照。放好后,用鑷子輕按紙片表面,于37 ℃恒溫培養箱培養24 h,觀察抑菌圈的大小。實驗重復3次取平均值得出抑菌圈大小,通過比較得出不同質量濃度的蘆丁藥液對3種菌的抑菌效果。
利用Excel 2003進行標準曲線的繪制與數據分析。
3 g刺梨經提取與精制后可得粗蘆丁0.345 g、精制蘆丁0.167 g。
標準曲線的繪制如圖3所示,標準曲線方程為y=11.575x+0.0224(R2=0.9945),說明其在濃度范圍內具有良好的線性關系。
圖1 標準曲線
樣品待測液在510 nm波長下吸光度為0.168,所以樣品的含量為0.0127 mg/mL,經公式(1)計算得到精制蘆丁中蘆丁含量百分比為31.75%,因此刺梨中蘆丁含量為17.67 mg/g。
穩定性測定結果如表2所示,5 h內樣品的吸光度值為6.0097~6.0104,變化不大,表示樣品在5h內保持穩定。
表2 5h內樣品吸光度值的變化
如表3所示為蘆丁抑菌性檢測結果。3個菌種在不同質量濃度的實驗藥液下受到不同程度的抑菌,且隨著實驗藥液濃度的增大,抑菌圈更為明顯,表明蘆丁具有明顯的抑菌效果,且濃度越大,抑菌效果越好。對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯,另外兩種則極其微弱。4種濃度下,金黃色葡萄球菌的抑菌圈均大于其余兩種菌,且抑菌效果為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。
表3 實驗藥液對各個菌種抑菌圈的大小
采用堿提取、酸沉淀法提取刺梨中的蘆丁,取得了較好的效果。此方法具有提取率高、成本低廉、操作容易、提取純度較高以及方法可靠準確等特點,具有很好的應用價值,對促進該藥材的進一步推廣具有重大意義。
蘆丁對3個菌種均具有一定的抑菌作用,且隨著質量濃度的增加,抑菌作用更為明顯。蘆丁對3種菌的抑菌大小為:金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。