間充質干細胞來源的外泌體在炎癥性腸病治療中的作用機制及應用前景

楊少鵬 綜述 張曉嵐 審校

炎癥性腸?。╥nf lammatory bowel diseases，IBD）是一種病因和發病機制尚不十分明確的非特異性腸道疾病，主要包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，其發病率逐年提高[1]。該病病程長，易復發，甚至出現各種全身并發癥及癌變，嚴重影響患者的生活質量與生存期。目前治療IBD 的藥物如糖皮質激素及免疫抑制劑等不良反應較多，對于重癥患者療效有限[2]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）是發病機制中關鍵的靶點，抗TNF 藥物英夫利西單抗和阿達木單抗等生物制劑的問世讓IBD 的治療效果得到了很大的改善，是重癥患者的“拯救性”治療藥物。然而，約有30%的患者對英夫利西單抗原發性無應答[3]，并且近20%～40%患者由于繼發性失應答或嚴重的不良反應而停藥[4-5]，其他新型生物制劑也仍處于起始階段。因此，探索IBD新的治療手段對改善目前的治療困境具有重要意義。

干細胞移植是IBD 治療領域的研究熱點，其中間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因具有抑制炎癥、調節免疫紊亂及促進黏膜修復等作用，有望成為IBD 的新興治療手段。隨 著研究不斷深入，研究者們發現經靜脈移植的MSCs 大多數停留在肝臟與肺部，只有＜ 1%會最終定植于受損腸道[6-7]，卻仍能有效緩解結腸炎小鼠的腸道炎癥。這些研究間接說明MSCs 可能通過分泌具有抗炎功能的生物活性物質發揮作用。MSCs 來源的外泌體（mesenchymal stem cells- derived exosome，MSCs-Exo）是MSCs 通過旁分泌的納米級細 胞外囊泡，具有MSCs 的大部分功能，無惡性分化且較MSCs免疫原性更低[8]，更好地彌補MSCs移植應用中的不足。本文綜述了MSCs-Exo 的概況及其在IBD 治療中的機制及應用前景，以期為深入研究MSCs-Exo 治療IBD 方面提供借鑒。

一、外泌體的形成、成分與功能

外泌體是1981年首次由Trams 等[9]提出的一類直徑約40～160 nm（平均100 nm）的納米級雙層膜結構的外囊泡。外泌體的形成始于細胞內吞與細胞膜內陷，細胞通過這兩種方式將胞外的物質，如蛋白質、脂類以及代謝產物連同細胞表面蛋白一起進入細胞，在高爾基體與內質網的作用下形成早期胞內體[10]。早期胞內體經發育成熟后成為晚期胞內體，晚期胞內體膜包裹多個含有特異分選的蛋白、核酸等物質的管腔囊泡形成多泡體（multivesicular bodies，MVBs）。隨后，大部分MVBs 與溶酶體或自噬小體融合最終導致 MVBs 的內含物降解，而少數MVBs 通過其膜表面的CD63、溶酶體跨膜蛋白1、溶酶體跨膜蛋白2 等與細胞質膜融合，并向胞外釋放將所含的管腔囊泡形成外泌體[11-13]。

外泌體含有豐富的內容物，例如蛋白質、核酸和脂質等。根據ExoCarta 數據庫（http://www.exocarta.org/）最新顯示，已在外泌體中檢測出41 860種蛋白、1 116種 脂質、3 408種信使RNA（messenger RNA，mRNA）及2 838種微小RNA（microRNA，miRNA），它們分別在外泌體中扮演十分重要的角色。例如外泌體的胞漿蛋白Rabs 和Annexin 可調節膜骨架動態性且有利于膜融合[14]；而膜蛋白CD9、CD63 及CD81定位于外泌體的表面并用于外泌體的鑒定[15]。脂質中的神經酰胺與外泌體的形成與釋放密切相關[16]。外泌體中的另一重要的物質miRNA 是眾多研究者們關注的焦點，當母細胞分泌的外泌體進入靶細胞后，它們攜帶的miRNA 將與靶基因結合調控其表達進而影響靶細胞生理功能。目前人們對外泌體內容 物在不同疾病中作用的了解仍十分有限，何種內容物為外泌體發揮功能的 關鍵分子值得進一步探索。

二、MSCs-Exo 在IBD 中的治療作用

（一）MSCs-Exo 具有治療IBD 的潛能

外泌體不但能夠反應機體的生理狀態，還與其來源的細胞具有相似的功能。因此，外泌體除了可用于作為疾病的診斷標記物外，其治療功能更是備受關注，尤其是來源于MSCs 的外泌體。MSCs 是一類來 源于中胚層的多能干細胞，主要存在于結締組織和器官間質中，能夠發育成骨、脂肪等并可以接受移植[17]，是目前基礎和臨床研究最廣泛的干細胞種類之一。最初研究者發現，將MSCs 的條件性培養基注射到實驗性結腸炎小鼠的腹腔后，可緩解腸道炎癥，減輕疾病活動指數并且提高模型鼠的存活率，與MSCs 療效無明顯差異[18]。該研究初步說明了MSCs 可能通過旁分泌途徑發揮抗炎功能。國內學者Yang 等[19]在2015年從骨髓MSCs 中分離出細胞外囊泡（主要為微囊與外泌體），進行動物實驗發現MSCs 來源的外囊泡可逆轉三硝基苯磺酸鈉誘導的實驗性結腸炎。因此，該研究在MSCs-Exo 治療IBD 研究領域中打開了新視角。

（二）MSCs-Exo 治療IBD 的機制

MSCs 應用于IBD 治療的研究已經取得較大的進展，但是MSCs-Exo 在IBD 中的治療作用與機制的探索仍處于起步階段。MSCs-Exo 治療IBD 的作用機制可能是多方面的，從現有的研究上看，主要集中在免疫調節及促進腸道上皮屏障修復兩大方面。以下將主要從這兩方面介紹MSCs- Exo 治療IBD 的可能機制。

1.MSCs-Exo 調節腸黏膜固有免疫：腸黏膜免疫異常，主要包括固有免疫和適應性免疫，是導致 IBD 發病的關鍵因素[20]。固有免疫為腸黏膜免疫異常的啟動因素，巨噬細胞作為抗原遞呈細胞參與其中并發揮重要作用。目前多數研究主要集中于MSCs-Exo 對巨噬細胞的調控方面，尤其是MSCs-Exo 調控巨噬細胞向抗炎表型分化在IBD 中的作用及機制等方面已經取得進展。體外研究發現，將脂多糖刺激后的巨噬細胞與來自骨髓MSCs-Exo 共培養，發現24 h后帶有綠色熒光標記的MSCs-Exo 能夠被巨噬細胞攝取，將M1型促炎巨噬細胞分化為M2型抗炎巨噬細胞，下調白介素 -6（interleukin 6，IL-6）、TNF-α 及IL-12 等炎癥因子的表達[21]。該現象也在動物實驗中得到進一步證實[21-22]。值得注意的是，當應用氯膦酸二鈉脂質體清除小鼠體內的巨噬細胞后，發現MSCs-Exo 在實驗性結腸炎小鼠中的 治療效果降低[23]。因此，巨噬細胞可能是MSCs-Exo 發揮治療作用的關鍵效應細胞。有學者進一步研究發現，脂肪MSCs-Exo 中含有炎癥保護因子TNF-α 刺激基因-6（TNF-α stimulated gene-6，TSG-6），該抗炎因子可能是調控M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉化的關鍵蛋白[24]。

2.調節適應性免疫：適應性免疫是IBD 發生并呈慢性持續狀態的重要環節，CD4+T細胞是腸黏膜免疫的主要效應細胞。在抗原刺激下CD4+T細胞可被誘導分化為調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T細胞（T helper cell，Th）。目前MSCs-Exo 對適應性免疫調控的研究尚不多見，主要集中于Th17 及Treg細胞。Th17細胞參與IBD 的發生，Th17細胞過度增殖與活化與潰瘍性結腸炎的疾病活動情況有關[25]。Chen 等[26]發現來源于骨髓MSCs 的外囊泡（包含外泌體）可能通過抑制Th17細胞轉錄因子RORγt及STAT3 的表達，從而下調結腸炎大鼠脾臟及腸系膜淋巴結中Th17細胞的比例及IL-17A、IL-21 等炎癥因子的分泌減輕腸道炎癥，其治療效果可能存在劑量依賴。然而該研究所提取的骨髓MSCs 外囊泡直徑為30～1 000 nm，成分相對復雜，可能存在外泌體以外的物質，因此未能直接證明MSCs-Exo 對Th17細胞的調控作用。具有免疫耐受調節功能的Treg細胞在維持腸道黏膜免疫的穩態中扮演著重要的角色，IBD患者多存在Treg細胞數量或功能異常。An 等[24]分離出犬骨髓的MSCs-Exo 與犬的外周血單個核細胞共培養，發現MSCs-Exo 可提高Foxp3+T細胞比例；進一步通過動物實驗發現與對照組相比，腹腔注射MSCs-Exo 的實驗性腸炎小鼠腸道炎癥更輕，結腸黏膜中Foxp3+T細胞數提高。該研究從細胞及動物兩個水平上說明了MSCs-Exo 調控Treg細胞的分化可能是其治療IBD 的重要途徑。

3.提高MSCs-Exo 免疫調節功能的途徑：除此之外，應用炎癥因子對MSCs 進行預處理可能提高MSCs-Exo 的免疫調節功能及抗炎能力。有研究應用TNF-α 及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）預處理MSCs后再提取外泌體，發現預處理后的MSCs-Exo 中具有免疫抑制功能的蛋白，如TSG-6、轉化生長因子-β 及前列腺素E2 等，其表達均高于未處理組；而且經TNF-α 及IFN-γ 預處理后的MSCs-Exo促進Treg細胞及M2型抗炎巨噬細胞分化的能力有所提高，在實驗性結腸炎小鼠中的治療效果更好[27]。MSCs 的免疫調節能力與其所處的微環境密切相關，不同培養條件所獲得的MSCs-Exo 免疫調節功能可能存在差異[28]。因此，從改變MSCs 的培養條件為視角，如缺氧、炎癥因子預處理及3D 培養等，探索提高MSCs-Exo 治療效果的方案值得進一步研究[29-30]。

4.MSCs-Exo 促進腸上皮屏障修復：腸上皮屏障由腸上皮細胞緊密連接組成，在抵御病原體入侵及維持腸黏膜正常功能中發揮重要作用，而腸上皮屏障損傷是IBD 的重要病理改變[31]。骨髓MSCs 分泌的外囊泡通過下調實驗性結腸炎大鼠結腸中caspase3、caspase8 及caspase9 的表達，從而抑制腸上皮細胞的凋亡修復受損腸道，并且這種抑制效應與所注射的外囊泡劑量有關[19]。另一研究將MSCs-Exo 注射到壞死性小腸結腸炎大鼠模型中，4 h后檢測大鼠血清發現注射MSCs-Exo 大鼠血清中FITC-D 濃度低于PBS 注射組，證明了MSCs-Exo 能夠降低腸黏膜的通透性，進而維持腸上皮屏障的完整，促進受損腸道修復[32]。McCulloh 等[33]通過應 用不同細胞來源的MSCs-Exo 對同樣的疾病模型進行干預后也證實了這一現象。以上的研究均未對MSCs-Exo 修復腸上皮屏障的機制做進一步探討。

5.MSCs-Exo 通過miRNA 發揮治療作用：除了上述介紹的作用機制外，MSCs-Exo 還可能通過miR-146a 與炎癥基因TRAF6 和IRAK1 靶向結合抑制基因的表達，從而減輕腸道炎癥[34]。其次，MSCs-Exo 還能通過miR-200b 抑制腸上皮間質轉化途徑，減少實驗性結腸炎相關腸纖維化的發生[35]。以上結果表明，MSCs-Exo所攜帶的miRNA 可能是其發揮治療作用的另一重要內容物。此外，抑制泛素蛋白表達，進而降低NF-κB 和mTOR 的活化也是MSCs-Exo 改善腸道炎癥的機制之一[36]。

三、MSCs-Exo 在IBD 中的應用前景

與MSCs 相比，其分泌的MSCs- Exo 具有更低的免疫源性，而且無細胞增殖特性，能在體內穩定存在等優勢[36]，可用于彌補MSCs 移植的不足甚至可能替代MSCs 成為IBD 的新興治療方法。在美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）注冊的臨床試驗（ClinicalTrials.gov）顯示，MSCs- Exo 在臨床試驗中的研究主要治療的疾病為Ⅰ型糖尿病、腦血管疾病及黃斑裂孔等，還未涉及到IBD[11]。目前MSCs-Exo 在IBD 中的研究尚不多見，其中大部分為臨床前基礎研究。實驗用于提取MSCs-Exo 的MSCs 主要來源于臍帶、骨髓或者脂肪，并且已經在細胞及動物水平上開展研究，以驗證MSCs-Exo 在IBD 治療中的有效性。在細胞實驗中，Rager 等[32]通過腸上皮細胞劃痕試驗發現骨髓來源的MSCs-Exo 提高腸上皮細胞劃痕的愈合率，改善腸上皮屏障功能；此外，MSCs-Exo 被巨噬細胞攝取后可抑制M1型巨噬細胞極化，下調炎癥因子水平發揮抗炎作用[21,24]。在動物實驗方面，研究所采用的動物模型大部分為三硝基苯磺酸和葡聚糖硫酸鈉誘導的實驗性結腸炎大鼠或小鼠模型。這些研究重點觀察了MSCs- Exo 的治療作用，證實了MSCs-Exo 能夠減輕結腸炎動物模型便血、體重下降等癥狀并改善組織病理評分，提高了動物的存活率[21,36,38]，其機制可能與MSCs-Exo 具有抗炎、調節免疫及促進腸道修復等作用有關。這些 研究為未來MSCs-Exo 在IBD 臨床治療中的應用奠定了基礎。因此，MSCs-Exo 在IBD 的治療中具有廣闊的應用前景。

四、MSCs-Exo 在IBD 治療中的局限性

雖然大多數基礎實驗表明MSCs-Exo 是潛在治療IBD 的“新武器”，但MSCs-Exo 應用于IBD 的臨床治療仍存在許多問題亟待解決。首先，MSCs-Exo 除了含有蛋白質、脂質及miRNA 等內容物外，可能還含有其他物質，如lncRNA、piRNA及circRNA 等非編碼RNA[39]。目前人們對于這些RNA 的功能了解不多，它們在IBD 中發揮什么作用、何種非編碼RNA發揮主要作用仍有待確定。其次， 動物實驗表明MSCs-Exo 的治療效果存在劑量依賴[26,33]，而且MSCs-Exo 應用于臨床試驗前更需要確定安全有效的劑量范圍。因此，MSCs-Exo 應用于臨床試驗前需要確定標準化定量的方法。目前用于確定MSCs-Exo 劑量主要根據提取外泌體母細胞的數量、外泌體的蛋白濃度或者外泌體的粒子數等，哪種量化方法更適用于臨床，仍存在許多爭議[40]。最后，不同的分離方法所獲得的MSCs-Exo 純度及數量可能存在差異，而且不同的給藥途徑可能影響IBD 的治療效果[41]。因此，MSCs-Exo 需要不斷優化提取方法，選擇合適的給藥途徑以提高臨床療效。

五、總結與展望

MSCs-Exo 免疫源性低、易保存且運輸方便，同時具有MSCs 大部分功能，有望成為一種新興的“無細胞”治療方法。如前文所述，目前MSCs-Exo 在治療IBD 中的研究尚處于起步階段，仍存在許多問題未解決。在探索MSCs-Exo內容物的功能方面，研究多集中于探討MSCs-Exo 通過遞送miRNA 發揮治療作用。然而MSCs-Exo 除了含有miRNA 外，還有大量具有功能的非編碼RNA。以MSCs-Exo 為載體，利用第三代基因組測序的技術，尋找其 中具有關鍵作用的非編碼RNA 并探討它們對靶細胞表觀遺傳調控的潛能，對闡明MSCs-Exo 治療IBD 的作用機制具有重要意義。另一方面，結合IBD 以消化道受累為主的疾病特征，對比不同給藥途徑及不同劑量在治療效果中的差異，可能為優化IBD 的治療方案提供實驗依據。

綜上所述，由于獨特的生物學特性及功能，MSCs-Exo 可能成為IBD 潛在的治療藥物。圍繞著MSCs-Exo 內容物的功能、提取與定量標準及給藥途徑等方面展開研究，將加快MSCs-Exo 應用于臨床治療IBD 的步伐。