金銀花總黃酮對四氯化碳致大鼠肝纖維化的影響及機制

徐曉燕 苗 芳 王曉丹 高永峰 張志遠 蘇設鎮

山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)，山東 泰安 271016

金銀花為忍冬科植物忍冬(LoniceraejaponicaerFlos)的干燥花蕾或帶初開的花，為臨床常用中藥，具有清熱解毒、疏散風熱之功效[1]?，F代藥理研究證明，金銀花及活性成分具有優良的抗氧化、自由基清除、抗炎及調節心血管系統等作用[2- 4]，但是有關金銀花黃酮抗肝纖維化的作用鮮有報道。因此本研究通過四氯化碳(CCl4)復制大鼠肝纖維化模型，研究金銀花總黃酮對大鼠肝纖維化的生化指標及形態學的影響，并通過體外培養肝星狀細胞(HSC)，觀察金銀花總黃酮對HSC增殖、凋亡的影響，評價金銀花總黃酮對肝纖維化的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

健康清潔級SD大鼠(200±20)g，購于魯抗動物中心(動物合格證:2008A010)；HSC細胞(細胞株)，購自中國醫學科學院；金銀花中藥飲片，購自泰安金泰聯醫藥商行；SOD、GSH- Px、MDA、Hyp測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產品；噻唑藍(MTT)購自sigma公司；細胞凋亡測試試劑盒(南京凱基生物技術有限公司)；BP211D型分析天平(美國Sar- torius公司)；酶標儀(瑞士TECAN公司，M200pro)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1金銀花總黃酮的提取、純化及含量測定 中藥飲片金銀花使用70%乙醇回流提取3次，得金銀花總黃酮粗品。粗品選用AB- 8大孔吸附樹脂70%乙醇洗脫，收集洗脫液，干燥得金銀花總黃酮。以蘆丁為標準品，測得所提取樣品中金銀花總黃酮的含量為71.28%，備用。

1.2.2動物分組給藥及肝纖維化模型的制備 大鼠48只，隨機分為對照組，模型組及金銀花總黃酮低、高劑量組；其中金銀花總黃酮低、高劑量組分別灌胃金銀花總黃酮100 mg/kg、200 mg/kg，對照組及模型組灌胃等容量生理鹽水，連續6周。給藥期間，除對照組外其他各組大鼠皮下注射40%CCl4油溶液1 mL/kg，每周2次，連續注射6周，同時給以10%乙醇代水飲，復制CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型；對照組注射等容量大豆油。末次給藥 24 h后心臟取血，收集血清檢測血清ALT活性和Hyp含量，處死大鼠取肝臟檢測肝臟MDA含量和SOD、GSH- Px活性，并進行肝臟組織切片，H- E染色觀察病理改變。

1.2.3HSC細胞增殖試驗 培養HSC細胞，以MTT比色法檢測HSC的增殖。培養的HSC以含小牛血清的DMEM制備為5×104個/mL細胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養24 h后，對含細胞的孔進行分組，每個劑量組5個復孔，分組情況如下：(1)對照組，HSC細胞繼續用100 μL DMEM培養基進行培養；(2)藥物處理組，棄去原有的培養基后用100 μL相應濃度200、100、50、25 μg/mL的含藥培養基繼續培養。分組處理后培養48 h，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，微型振蕩器振蕩10 min，于酶標儀490 nm波長下檢測吸光度。

1.2.4HSC細胞凋亡試驗 培養HSC細胞，以流式細胞儀檢測細胞凋亡。細胞以1.5×106/孔的接種量接種于6孔培養板上。藥物分組處理后，加入不含EDTA的胰酶消化，培養液終止消化，PBS沖洗2次，收集于流式管中，離心5 min(1 000 r/min)，棄去上清液，每管加入PBS將細胞混懸后離心5 min(1 000 r/min)，棄上清，每管加入300 μL的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μL的 AnnexinV- FITC混勻放置10 min，加入5 μL的Propidium Iodide，混勻上機檢測。

2 結 果

2.1 金銀花總黃酮對肝纖維化大鼠血清ALT、Hyp含量的影響

模型組大鼠血清ALT、Hyp顯著升高，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.01)，而金銀花總黃酮低、高劑量組血清ALT、Hyp與模型組相比顯著減少，并且具有一定的量效關系，差異有統計學意義(P﹤0.05)。結果見表1。

表1 金銀花總黃酮對大鼠血清ALT、Hyp的影響各組n=7)

注：與對照組比較，▲P<0.01；與模型組比較，★P<0.05。

2.2 金銀花總黃酮對肝纖維化大鼠肝組織MDA、SOD和GSH- Px的影響

與對照組比較，模型組肝組織中MDA含量增高，SOD和GSH- Px活性下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，金銀花總黃酮低、高劑量組的MDA含量下降，GSH- Px、SOD活性提高，差異有統計學意義(P<0.05)。具體見表2。

2.3 金銀花總黃酮對肝纖維化大鼠肝臟形態學的影響

HE染色發現，對照組大鼠肝臟組織的肝小葉結構完整，肝細胞索由中央靜脈向四周排列整齊；模型組匯管區炎性細胞、壞死細胞增多，細胞索排列紊亂，纖維間隔增厚；金銀花總黃酮低、高劑量組肝纖維化程度明顯減輕，對炎性細胞浸潤、膠原纖維的增生以及假小葉的形成等均有明顯的改善。具體見圖1。

表2 金銀花總黃酮對大鼠肝臟MDA、SOD、GSH- px含量的影響各組n=7)

注：與對照組相比，▲P<0.01；與模型組相比，★P<0.05。

A.金銀花總黃酮低劑量組；B.金銀花總黃酮高劑量組；C.對照組；D.模型組。

2.4 金銀花總黃酮對HSC增殖的影響

與對照組比較，藥物處理組均能不同程度抑制HSC的增殖，呈明顯劑量- 效應關系，見表3。

表3 金銀花總黃酮對HSC增殖的影響

注：與對照組比較，**P<0.001，*P<0.05。

2.5 金銀花總黃酮對HSC細胞凋亡的影響

通過流式細胞儀檢測，藥物處理組與對照組比較，其中早期凋亡率與晚期凋亡率均高于對照組，并具有明顯劑量依賴性，顯示金銀花總黃酮可明顯促進肝星狀細胞的凋亡。結果見圖2。

3 討 論

研究表明，肝臟在CCl4刺激下產生大量活性氧自由基，使自由基代謝失去平衡，過多的活性氧自由基會攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸而發生脂質過氧化，引起血漿ALT活性的增高。因此，ALT的活性是肝細胞損壞的重要指標[5- 6]。由實驗結果可以看到，模型組大鼠血清中的ALT活性明顯升高，說明CCl4已經造成了肝臟細胞損傷；金銀花總黃酮的高、低劑量組的大鼠血清中的ALT活性與模型組的相比顯著降低，說明金銀花總黃酮的高、低劑量組對由CCl4所引起的大鼠肝損傷具有一定的保護作用。長期的肝細胞損傷、變性、壞死致內皮細胞釋放各種細胞因子增加，細胞因子進一步激活靜息狀態的星狀細胞，使之轉化為肌成纖維樣細胞，其過度增殖，同時大量合成各種細胞外基質，過度沉積從而導致肝纖維化形成。Hyp是構成機體內膠原蛋白的特有成分，臨床上血和尿中Hyp 的檢測已成為衡量機體膠原組織代謝的重要指標，它能間接反映組織中膠原代謝狀況。肝纖維化時由于肝實質內膠原纖維組織明顯增多,可導致血和肝組織Hyp 含量升高,因此直接檢測Hyp 含量可反映肝纖維化的程度。實驗結果表明，模型組大鼠血清中的Hyp明顯升高，說明CCl4連續皮下注射可以誘導肝纖維化形成；而金銀花總黃酮的高、低劑量組的大鼠血清中的Hyp與模型組的相比顯著降低，說明金銀花總黃酮的高、低劑量組對由CCl4所誘導的大鼠肝纖維化具有一定的干預作用。

A.對照組未染色；B.對照組；C.金銀花總黃酮200μg/mL；D.金銀花總黃酮100μg/mL;E.金銀花總黃酮50μg/mL;F.金銀花總黃酮25μg/mL。

肝損傷時由于肝臟組織抗氧化能力降低，自由基積累，產生過多的脂質過氧化物，MDA的含量不僅能表示肝細胞膜脂質過氧化的強弱，而且可以間接的體現自由基對肝細胞的損害程度[5]。實驗結果表明，模型組大鼠肝組織中MDA的含量明顯增加，而金銀花總黃酮組肝組織中MDA水平明顯下降，說明金銀花總黃酮能抑制脂質過氧化反應，從而保護肝臟組織免受損傷。肝組織中SOD能阻止其破壞肝細胞，GSH- Px能特異地催化還原性GSH對過氧化氫的還原反應從而保護細胞膜結構與功能的完整性。本實驗結果表明，與對照組相比，模型組大鼠肝臟SOD、GSH- Px活性明顯降低，而金銀花總黃酮組SOD、GSH- Px活性明顯升高，表明金銀花總黃酮有明顯對抗肝組織脂質過氧化反應、保護抗氧化活性的作用。病理學檢查是判斷肝纖維化程度，評價抗肝纖維化藥物療效的可靠標準。本實驗結果表明，病理組織學HE染色發現模型組大鼠肝細胞損傷嚴重，肝纖維化程度極重， 而金銀花總黃酮組可明顯改善大鼠肝纖維化程度，并且呈劑量相關關系，表明金銀花總黃酮具有明顯減輕肝損傷，減少纖維條索生成的作用，對肝纖維化的形成具有一定的干預作用。

肝纖維化是指肝臟內纖維性結締組織的大量異常增生,是一種“創傷愈合”的慢性漸進的病理過程[6]。多種因素誘發肝細胞損傷,導致肝Kupffer細胞、肝竇狀內皮細胞、肝成纖維細胞等其他類型肝細胞以及遷移的炎性細胞活化并釋放大量的細胞因子和可溶因子,與此同時這些因子導致肝星狀細胞(HSC)活化、分化與增殖,合成大量ECM,并逐漸沉積從而引起肝纖維化[7- 10]。本實驗研究發現金銀花總黃酮能抑制HSC的增殖，促進HSC凋亡，并呈劑量依賴性，體外實驗同樣提示金銀花總黃酮具有抑制肝纖維化形成的作用。