腎茶總黃酮調節腎缺血再灌注損傷大鼠腎小管上皮細胞凋亡的作用和機制*

郭銀雪 葛平玉

（貴州中醫藥大學第一附屬醫院 貴陽550004）

急性腎損傷（Acute Kidney Injury,AKI）是一種常見的由于外傷、手術、膿毒血癥、腎毒性藥物等因素引起的獲得性并發癥，在臨床中有較高的發病率和致死率，具有起病急、進展快的特點[1]。手術、外傷、膿毒血癥、腎毒性藥物等因素引起的腎缺血-再灌注損傷，是AKI發生和發展的一個重要因素[2]。研究表明，過氧化損傷引起腎小管上皮細胞（TECs）過度凋亡是腎缺血-再灌注損傷的重要病理過程；現代藥理研究也證明，腎茶黃酮類成分具有良好的清除自由基和抗氧化的作用[3]。我們推測腎茶總黃酮能通過減輕過氧化損傷以減少腎小管上皮細胞凋亡的途徑，達到減輕急性腎損傷的作用，本研究針對這一方面進行了觀察探討?，F報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 自貴州醫科大學動物實驗中心購進的60只清潔級雄性2月齡SD大鼠作為研究對象，體質量在250～300 g之間，自由飲食常規大鼠飼料，大鼠許可證號：SCXK（黔）2016-0001。

1.2 實驗用藥、試劑和儀器 腎茶地上部分全草，為唇形科植物貓須草 [Clerodendranthus spicatus（Thunb.）C.Y.Wu]的地上部分，從貴州中醫藥大學第一附屬醫院中藥房購進。腎茶總黃酮（TFC）采用最佳提取工藝提取獲得[4]。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）、一氧化氮合成酶（Nitric Oxide Synthase,NOS） 和 丙 二 醛（Malonyldialdehyde,MDA）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；TUNEL檢測試劑盒（羅氏Roche公司），羅氏全自動生化分析儀，熒光顯微鏡（日本Olympus公司），MR23i離心機（美國Thermo公司）。

1.3 動物模型建立 制模手術前6 h禁食，麻醉前稱重，預先制備10%的水合氯醛，腹腔注射麻醉，劑量按0.4 ml/100 g計算。麻醉后，大鼠取仰臥位固定于手術操作臺上，常規腹部手術備皮，碘伏消毒鋪無菌敷料，充分暴露手術區域。自腹正中行縱行切口進入腹腔，找到右腎后常規切除；充分游離暴露左腎及左腎動脈，無損傷動脈阻斷左腎動脈，左腎顏色由紅潤變為蒼白表示左腎急性缺血。阻斷1 h后恢復灌注，左腎顏色重回紅潤，提示成功恢復灌流。

1.4 分組與給藥 60只雄性實驗SD大鼠，常規飼料喂養7 d，采用信封法隨機分為對照組、模型組、腎茶總黃酮小劑量治療組和腎茶總黃酮大劑量治療組，每組15只。模型組及腎茶總黃酮小劑量治療組和腎茶總黃酮大劑量治療組均需構建腎缺血再灌注損傷模型。通過人與大鼠按體表面積折算的等效劑量比值計算各組給藥劑量。對照組、模型組以0.9%氯化鈉溶液灌胃（按1 ml/100 g劑量計算用量），治療組以腎茶總黃酮溶液灌胃（大劑量組400 mg/kg、小劑量組100 mg/kg），治療4 d。

1.5 觀察指標 （1）血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）檢測：采集大鼠尾靜脈血5 ml，注入離心管離心10 min，血清低溫保存，采用羅氏全自動生化分析儀測定Cr和BUN。（2）SOD活性通過黃嘌呤氧化酶法測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，NOS活性采用化學比色法測定。大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉后常規碘伏消毒鋪自制手術洞巾；打開腹腔，無菌條件下取出左腎，切取一半左腎，用4℃預冷0.9%氯化鈉溶液洗凈血液，吸干水分，用眼科剪剪取一半腎組織，稱重，按10 ml/g加0.9%氯化鈉溶液，使用玻璃勻漿器勻漿，制成10%腎組織勻漿，轉速4 000 r/min（r=142 mm），離心 10 min，取上清液置 4℃保存檢測。（3）TECs凋亡指數測定[5]：采用DNA斷裂的原位末端標記法 [Terminal Dexynucleotidyl Transferase（TdT）-mediated dUTP Nick End Labeling,TUNEL]檢測TECs凋亡，用10%福爾馬林固定剩余的一半左腎，依次進行脫水、透明、石蠟包埋，制成4 μm切片，行TUNEL檢測。應用圖文分析報告系統隨機采集10個不連續不重復高倍鏡視野（HPF，40×物鏡），記錄每個視野TUNEL陽性TECs個數。腎小管上皮細胞凋亡指數（Apoptotic Index,AI）=陽性細胞數/視野所見細胞總數×100%。

1.6 統計學方法 數據處理采用SPSS25.0統計學軟件，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較應用最小極差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組實驗大鼠BUN和Cr水平比較 模型組肌酐、尿素氮水平與對照組比較顯著升高（P＜0.05），顯示造模成功；腎茶總黃酮大劑量治療組治療4 d后與模型組相比較，BUN和Cr明顯下降（P＜0.05）。見表1。

表1 各組實驗大鼠BUN和Cr水平比較（±s）

表1 各組實驗大鼠BUN和Cr水平比較（±s）

注：與模型組相比較，*P＜0.05；與對照組相比較，△P＜0.05。

組別nBUN（mmol/L）Cr（μmol/L）腎茶總黃酮小劑量組腎茶總黃酮大劑量組模型組對照組15 15 15 15 20.13±1.44 15.13±1.44*25.34±2.46△13.84±1.53 76.64±11.21 68.64±11.21*94.76±13.83△55.41±9.83

2.2 各組實驗大鼠AI和腎組織內SOD、MDA、NOS含量比較 與模型組相比較，腎茶總黃酮大劑量組AI和腎組織MDA、NOS含量顯著降低（P＜0.05），SOD水平顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組實驗大鼠AI和腎組織內SOD、MDA、NOS含量比較（±s）

表2 各組實驗大鼠AI和腎組織內SOD、MDA、NOS含量比較（±s）

注：與模型組相比較，*P＜0.05；與對照組相比較，△P＜0.05。

組別 n AI（%）SOD（×103U/g）MDA（μmol/g）NOS（×103U/g）腎茶總黃酮小劑量組腎茶總黃酮大劑量組模型組對照組15 15 15 15 7.37±4.29 4.37±4.29*10.39±6.26△3.11±0.84 23.44±4.62 29.84±5.58*19.31±2.90△31.23±5.27 14.55±1.97 11.32±0.91*16.29±3.51△8.34±0.61 12.66±3.37 11.57±2.25*19.46±4.45△9.76±1.58

3 討論

細胞凋亡是由一定信號刺激引起，在基因調控下進行自主程序化的細胞死亡，這個過程受到多種因素的影響，在正常生理或病理過程中均可發生，是機體維持細胞數量平衡和清除異常細胞的關鍵機制[6]。在缺血性腎損傷、藥物性腎損害、梗阻性腎臟病等各種急性腎損傷的病理過程中，TECs凋亡都發揮著重要的作用。氧化應激是指機體在各種有害刺激下，自由基在體內產生的一種負面作用，表現為活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等高活性分子產生過多和消除降低，氧化與抗氧化系統失衡，生物膜脂質過氧化，細胞內酶和蛋白變性，DNA損傷，細胞的凋亡或死亡，組織受損[7～8]。本實驗結果顯示，在急性腎缺血再灌注后，模型組腎組織內NOS顯著升高，腎小管上皮細胞凋亡指數明顯增加，導致腎功能發生異常。這表明TECs凋亡參與了急性缺血性腎衰竭的發生和進展，其機制與腎組織內自由基介導的氧化損傷有關。

腎茶為唇形科植物貓須草的地上部分，具有利水消腫、利尿化石、養腎保腎、涼血止血等功效，因其悠久的應用歷史和確切的治療功效，被越來越多的學者重視并進行了深入的研究?，F階段，經眾多國內外學者深入研究，已有200余種化合物自腎茶中經提取分離得到，其中主要包括多甲基黃酮化合物、橙黃酮、澤蘭黃素等20多種黃酮類化合物。這些黃酮類化合物具有良好的抑制、清除自由基及抗氧化作用[9]，被廣泛用于治療急、慢性腎炎或風濕性關節炎等疾病。

本實驗表明，經大劑量腎茶總黃酮治療后，實驗大鼠腎組織中SOD活性明顯增高，MDA和NOS水平明顯降低?？傊?，腎茶總黃酮能夠減輕腎缺血再灌注損傷大鼠的急性腎損傷，這種作用可能與其升高大鼠腎組織內SOD水平、降低MDA和NOS水平、抑制腎小管上皮細胞凋亡有關。