犀角地黃湯合銀翹散影響PKC-SSeCKS介導的F-actin變構抑制流感病毒誘導的PMVEC通透性增加①

劉歡葦 張 舒 鄧 迪 毛 欽 郭 銳 吳 珺 郝 鈺

(北京中醫藥大學生命科學學院免疫與微生物學系,北京 102488)

犀角地黃湯合銀翹散(Xijiao Dihuang decoction combined with Yinqiao powder,XDY)源自吳鞠通《溫病條辨·上焦篇》，銀翹散清解衛分之毒，犀角地黃湯解營血毒，兩方相合可達清熱解毒、涼血止血、化瘀通絡之效，先證用藥，截斷病勢。前期動物實驗證明：XDY可明顯降低病毒性肺炎模型小鼠體內炎性因子和肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中白細胞總數，改善肺指數、肺病理改變，降低肺血管通透性，下調肺組織中細胞間黏附分子(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-l)和血管細胞黏附分子(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-l)的表達[1-3]。但XDY對病毒誘導肺血管通透性增加的影響和機制還未闡明。

PMVEC與肺泡上皮細胞共同構成肺泡-毛細血管屏障，F-actin變化會直接影響其骨架完整性并造成通透性改變[4]，在病毒性肺炎發生過程中，PKC通路被激活，其下游底物SSeCKS由在正常細胞內散在分布轉移至細胞核周和細胞皺褶處并誘導F-actin變構形成絲狀應力纖維[4，5]，導致PMVEC通透性增加，屏障功能下降，細胞和含蛋白的液體滲出增多，形成肺水腫[6]。

因此，本研究將觀察XDY對流感病毒誘導的PMVEC通透性改變和對PKC-SSeCKS介導的F-actin變構的影響，以探討XDY治療病毒性肺炎的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 根據陳瑞華等[7]的方法進行大鼠PMVEC原代培養和鑒定。

1.1.2病毒 流感病毒甲型鼠肺適應株A/FM/1/34(H1N1)(FM1)，中國預防醫學科學院病毒學研究所提供，-70℃保存。雞胚尿囊腔中傳代兩次后，收集尿囊液。用微量血凝試驗(HA)檢測病毒血凝效價為1∶512，病毒感染MDCK細胞24、48、72 h后，采用Reed-Muench法計算TCID50。流感病毒FM1的TCID50為10～4.6/0.1 L。

1.1.3藥物 犀角地黃湯合銀翹散(水牛角30 g、生地30 g、芍藥12 g、丹皮9 g、連翹9 g、銀花9 g、苦桔梗6 g、薄荷6 g、竹4 g、生甘草5 g、荊芥穗5 g、淡豆豉5 g、牛蒡子9 g) 購自北京同仁堂藥店，制成水煎劑。根據張晨月等[2]的方法和劑量制備含藥血清。

1.1.4主要試劑和儀器 M199 培養基和胎牛血清(HyClone)；雙抗(Solarbio)；ECGS(BD);PKC活性檢測試劑盒(Promega);PKC抑制劑(Midostaurin);綿羊抗大鼠SSeCKS 抗體(Sigma)；TRITC標記的兔抗綿羊IgG(Jackson)；FITC-鬼筆環肽(Molecular Probes)；跨膜電阻儀(Millipore MERS00002)。

1.2方法

1.2.1內皮細胞通透性的檢測 將大鼠PMVEC(2×105cells) 接種于0.5% 明膠包被的Transwell 小室內，上、下室分別加入0.5 ml和1.5 ml M199 完全培養液，細胞達單層融合后，設置對照組、模型組(100TCID50FM1)、PKC抑制劑組(100TCID50FM1+10 μmol/L PKC抑制劑)和XDY組(100TCID50FM1+15%XDY含藥血清)。將跨膜電阻儀調至歐姆檔，將2個STX-2電極分別置于Transwell小室表面和下室內，于24 h測量各組阻抗值，并測未接種細胞的小室阻抗值，每室重復3次。TER= (測得阻抗值-空白阻抗值)× Transwell小室的底面積，單位為Ω·cm2。TER反映溶質離子傳遞電流的強弱，與細胞通透性呈反比。

1.2.2PKC活性的檢測 設置對照組、模型組、PKC 抑制劑組和XDY組。干預因素作用24 h后將各組細胞收集并勻漿，離心(4℃,14 000 r/min,5 min)取上清，按PKC活性檢測試劑盒操作說明測定上清液的PKC 活性，電泳檢測時，同一泳道條帶的灰度比值反映上清液中PKC 激酶活性。

1.2.3SSeCKS的mRNA和蛋白表達檢測 設置對照組、模型組和XDY組，干預因素作用24 h，收集細胞，按RNeasy Mini kit試劑盒說明書提取細胞總RNA，用TE10倍稀釋。根據GenBank 提供的SSeCKS 基因已知序列(AY695056),用Primer Premier 5.0軟件設計CDS區的上游引物序列為5′-AATCCATCCCAATCATAGTAAC-3′,下游引物序列為5′-TCTCAAGGTCCCAACAGC-3′，內參GAPDH 的上游引物序列為5′-ATGACCCCTTCATTGACC-3′,下游引物序列為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。PCR擴增按One-Step SYBR PrimeScript PT-PCR KitⅡ試劑盒說明書進行，結果以2-ΔΔCt表示。收集細胞，用蛋白裂解液提取蛋白，用BCA法進行蛋白定量。用Western blot 方法檢測SSeCKS 蛋白表達量。

1.2.4激光共聚焦顯微鏡觀察SSeCKS和F-actin在細胞內的定位和結構的改變 將5×108cells/L 的細胞100 μl種于激光共聚焦專用96孔板內，分組如上，干預因素作用24 h后，置于4%多聚甲醛中4℃固定1 h，以1% Triton X-100進行膜通透10 min，PBS清洗后，加正常兔血清室溫封閉1 h，傾去。SSeCKS用抗SSeCKS抗體4℃孵育過夜，洗滌后避光，以TRITIC熒光Ⅱ抗4℃孵育1 h；F-actin用FITC-鬼筆環肽染色，洗滌，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個樣品設3個復孔，進行3次獨立實驗。

2 結果

2.1XDY對流感病毒感染大鼠PMVEC通透性的影響 病毒作用于PMVEC 12 h左右TER開始下降，24 h下降最明顯(圖1A)，因此本研究選取24 h作為XDY含藥血清干預時間點。干預因素作用24 h 時，與對照組相比，模型組TER降低(P<0.01)；與模型組相比，PKC抑制劑組與XDY組TER明顯增高(P<0.01)，見圖1B。

2.2XDY對流感病毒感染大鼠PMVEC后PKC活性的影響 干預因素作用24 h后，與對照組相比，模型組PKC活性增強 (P<0.01)；與模型組相比，PKC抑制劑組和XDY組PKC活性降低(P<0.01) ，見圖2A、B。

圖1 大鼠PMVEC通透性的變化Fig.1 Change of rat TER of PMVECNote:A.Change of TER of PMVEC infected by influenza virus at different time points;B.Effect of XDY on TER of PMVEC infected by influenza virus Control;##.P<0.01,vs Model.

圖2 XDY對流感病毒感染大鼠PMVEC后PKC活性的影響Fig.2 Effect of XDY on activity of PKC of PMVEC infected by influenza Note:1.Control；2.Model；3.PKC inhibitor；4.XDY.**.P<0.01,vs Control;##.P<0.01,vs Model.

2.3XDY對流感病毒感染大鼠PMVEC后SSeCKS mRNA、蛋白表達和定位的影響 干預因素作用24 h后，模型組SSeCKS mRNA表達比對照組明顯增多 (P<0.05)；與模型組比，XDY組SSeCKS mRNA的表達明顯降低 (P<0.05)，見圖3A。流感病毒感染大鼠PMVEC 24 h后，模型組SSeCKS蛋白表達量明顯增多；與模型組比，XDY組SSeCKS的蛋白表達明顯降低，見圖3B。激光共聚焦顯微鏡下顯示，對照組PMVEC中SSeCKS均勻分布在細胞中；而模型組SSeCKS集中分布于核周；XYD組可明顯改善模型組SSeCKS分布情況，趨于正常，見圖3C。

2.4XDY對流感病毒感染大鼠PMVEC后F-actin在細胞內的定位和結構改變的影響 對照組PMVEC中F-actin主要分布在細胞周邊和核周，微絲微管分布均勻、排列整齊,胞周可見F-actin形成的致密周圍束；與對照組相比，模型組細胞周邊的F-actin致密束基本消失，形成應力纖維；與模型組相比，XDY的PMVEC在病毒作用后細胞骨架基本完整，可見F-actin分布于細胞周邊的致密周圍束，趨于正常，見圖4。

圖3 XDY對病毒感染大鼠PMVEC后SSeCKS mRNA、蛋白表達和定位的影響Fig.3 Effect of XDY on expression of SSeCKS mRNA and protein and its location in PMVEC infected by influenza virusNote:A.SSeCKS mRNA protein expression;C.SSeCKS location in PMVEC.*.P<0.05,vs Control;#.P<0.05,vs Model.

圖4 XDY對流感病毒感染大鼠PMVEC后F-actin分布和結構的影響(激光共聚焦顯微鏡)Fig.4 Effect of XDY on distribution and structure of F-actin in PMVEC infected by influenza virus(Laser scanning confocal microscopy)

3 討論

病毒性肺炎發生時，嚴重的炎癥反應可導致急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)，是影響患者預后和明顯增加死亡率的危險因素[8]。PMVEC通透性改變是發生ARDS的重要環節[9]，前期動物實驗結果提示，流感病毒感染的肺炎小鼠肺血管通透性升高，肺間質炎性滲出增多，肺指數升高；XDY可使肺炎小鼠肺組織通透性降低，滲出減少，肺指數降低。PMVEC是構成肺血管屏障的主要細胞，我們用原代培養的大鼠PMVEC為模型，采用跨膜電阻儀監測PMVEC的TER以觀察其通透性變化，結果表明XDY可顯著抑制流感病毒誘導的PMVEC通透性增加。同時發現，流感病毒感染的 PMVEC中PKC活性明顯增強，特異性PKC抑制劑可顯著抑制PMVEC中PKC活性并顯著抑制其通透性增加，說明流感病毒誘導的PMVEC通透性增加依賴PKC介導的信號通路。Src抑制蛋白激酶C的底物(SSeCK)是一種表達于血管內皮細胞的支架蛋白，相對分子量為280～290 kD，在急性肺損傷中作為炎癥反應蛋白過度表達[10]。

SSeCK是PKC的結合蛋白也是其底物，可以通過與PKC選擇性結合，破壞內皮細胞通透性穩定狀態[10]。體外培養過度表達異源性SSeCKS的成纖維細胞中發現纖維狀肌動蛋白、紐蛋白相關的細胞黏著斑缺失和細胞偽足樣突起的形成[5]。PKC信號通路激活后，其底物SSeCKS可誘導F-actin應力纖維的形成，緊密連接、黏附連接和內皮細胞-細胞外基質解聚，使PMVEC通透性增加，進而觸發級聯反應并放大肺部炎癥反應[10]，誘發ARDS。F-actin是構成內皮細胞骨架的主要成分，其變化直接影響PMVEC通透性。內皮細胞受到炎性介質刺激后，F-actin發生變構：球狀肌動蛋白聚合形成絲狀肌動蛋白，位于細胞膜附近的致密周圍束消失,形成應力纖維,導致細胞強烈收縮[4]，而SSeCKS由在正常細胞內散在分布轉移至細胞核周和細胞皺折處，最終導致細胞形態改變，細胞收縮，增大、增多細胞間的縫隙,使PMVEC通透性增加[5]。

本研究結果顯示，流感病毒感染PMVEC后，細胞中PKC活性增強，同時SSeCKS mRNA和蛋白表達增加，SSeCKS在細胞中的定位由在細胞內散在均勻分布變為集中于核周，而細胞內F-actin在細胞周邊形成的致密周圍束消失，微絲微管排列紊亂甚至消失，說明流感病毒感染所致PMVEC通透性增加與PKC-SSeCKS通路密切相關；XDY干預可使流感病毒感染后PMVEC中PKC活性降低，SSeCKS mRNA和蛋白表達減少，同時可見SSeCK在細胞中散在均勻分布，而細胞內F-actin在細胞周邊的致密周圍束又復出現，F-actin的變構被逆轉。以上結果說明，XDY可下調流感病毒激活的PKC-SSeCKS信號通路，降低SSeCKS的表達，減輕下游F-actin致密周圍束解聚的變構現象，阻止細胞收縮導致的細胞間隙增大，從而抑制流感病毒性肺炎中流感病毒引起的PMVEC通透性增高，緩解內皮細胞的損傷，減輕炎癥。

“毒損肺絡”是現代醫家在衛氣營血傳變規律的基礎上結合現代解剖學和病理學提出的病因病機學說。張偉等[11]將中醫學說的毒分內外，外毒為六淫、戾氣和環境毒邪等，致病途徑包括五官九竅和腠理經絡等與外界接觸的部位；內毒的致病途徑有機體代謝異常、五情失常和病理產物。肺絡布散于整個肺組織，分為氣絡和血絡，分別與解剖學中的氣管、支氣管和肺內毛細血管對應[12]。流感病毒是引起病毒性肺炎的最常見病原，屬外毒范疇，PMVEC屬肺之血絡，其通透性改變是病毒性肺炎的一個重要病理變化，也是引起ARD的主要原因[9]，因此，病毒性肺炎屬“毒損肺絡”范疇，治療病毒性肺炎應注重解毒與通絡，銀翹散可清解衛分毒，去除損害因素，犀角地黃湯清解營血分毒并化瘀通絡，兩方合用療效甚佳[13]。本實驗研究證明，XDY改善流感病毒感染所致的肺微血管通透性增加，是其清熱解毒、涼血止血、化瘀通絡的生物學基礎之一。