高濃度氧處理法阻斷蠶卵滯育

龔競，尚杉，張育浩，顏嘉敏，朱勇

(農業農村部蠶桑生物學與遺傳育種重點實驗室/西南大學生物技術學院，重慶400715)

家蠶Bombyxmori是一種經濟昆蟲，在我國有著5 000年的飼養歷史，在生理學、遺傳學、分子生物學和基因組學上取得了豐碩的研究成果。家蠶是典型的卵滯育昆蟲，不同品種蠶卵滯育的程度有所不同：北方地區蠶卵多為滯育品種，每年只孵化1次(一化性)或2次(二化性)；南方地區氣候溫暖潮濕，很多品種1年可孵化多次(多化性)[1]。其中，二化性品種可以通過調控母代的催青(解除滯育后的蠶卵在適當溫度等條件下誘導孵化的過程)飼養條件，如溫度、光照、濕度等來控制子代蠶卵的滯育性[2]。同時，人們在滯育卵產下后的適當時期，通過一些物理、化學方法阻止蠶卵進入滯育，如酸類浸漬、溫水浸漬、有機溶劑處理、摩擦、高濃度氧(O2)處理(簡稱高氧法)等[3-7]，使蠶卵進入活化狀態，按照人們生產生活的需要生長發育。在蠶業生產上，傳統采用HCl 處理法(簡稱HCl法)阻斷或者解除滯育。該方法對處理條件要求嚴格，導致蠶卵死亡的情況時有發生，并且HCl 的大量使用對環境會造成一定的危害，找到更安全、環保、便捷的阻斷滯育方法是保證蠶業生產順利發展的重要內容。

隨著轉座子在家蠶轉基因中的不斷完善，轉基因技術在家蠶基因功能研究、遺傳素材創新和生物反應器開發等領域發揮了重要作用[8-12]。由于轉基因家蠶制備需要經過篩選、驗證、雜交等多個步驟，還需要經過多代飼養獲得純品系，目前多化性品種的蠶卵仍然是轉基因家蠶研究的首選材料?？墒?，多化性材料必須進行連續飼養，不僅增加了生產成本和轉基因系統丟失的風險，而且多化性材料的經濟性狀跟實用的二化性品種比較起來還有一定差距，在產業應用中受到一定的影響。有研究者曾通過早浸酸(即傳統的HCl法)、低溫催青[13-14]等方法處理二化性品種的蠶卵，試圖獲得轉基因家蠶的非滯育卵，但是存在早浸酸時間范圍與顯微注射時間沖突及低溫催青時間過長等問題，使得這些方法在科研和生產應用上受到了限制。因此，有必要探尋更為高效的控制蠶卵滯育性的技術和方法，滿足蠶桑生產和轉基因研究對不同化性品種的需求。

本研究，采用高氧法對不同化性品種蠶卵和轉基因蠶卵材料進行阻斷滯育，調查處理后二化性蠶卵阻斷滯育的效果，對最佳處理條件進行篩選；以高氧法優選的處理條件，對照生產上傳統的HCl 法處理，比較二者阻斷滯育的效果。進而將該方法應用于一化性品種和顯微注射的轉基因蠶卵阻斷滯育，期望為生產上替代傳統阻斷滯育的HCl 法和在家蠶轉基因技術中加快轉基因材料選育進度提供安全環保的新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用試驗材料為二化性家蠶品種‘大造’，由西南大學家蠶基因資源庫提供，母代材料在25℃條件下催青，戊3胚子前自然光照，戊3胚子后每天18 h 長光照。蛹期25℃、相對濕度(RH)75%和自然光照保護，羽化后同一飼育區交配制種，產下滯育卵。另一試驗材料為一化性家蠶品種‘土耳其’，由中國農業科學院蠶業研究所提供。常規催青、常規飼養，蛹期25℃、RH75%和自然光照保護，羽化后同一飼育區交配制種，產下滯育卵。

1.2 載體材料

pBac［3xp3EGFP］載體[15]由家蠶基因組國家重點實驗室提供。

1.3 主要試劑及儀器

純氧(重慶強勝氣體有限公司)，HC l(重慶科試)，三氣培養箱(HF100，力康)，人工氣候箱(PGX-300C，寧波東南)，掃描電鏡(JCM 500，NIKON)，顯微注射儀(Eppendorf,德國)。

1.4 主要溶液及配制

HCl溶液：將HCl原液緩慢倒入純水中，攪拌均勻，待溫度降至室溫后用比重計測量其相對密度為1.100。

PBS緩沖液：Na2HPO40.72 g，KH2PO40.12 g，NaCl4 g，KCl 0.1 g，ddH2O 400mL，pH 調至7.4，定容至500mL。

1.5 主要試驗方法及步驟

1.5.1 蠶卵的處理1)高氧法：參考Sonobe 等[5]的研究，產卵后20 h 的蠶卵，用體積分數(φ)為30%、40%、50%、60%、70%和80%的O2分別處理40 h，每處理重復28個蛾圈；產卵后4、12、20、32和48 h的蠶卵，用φ為70%的O2分別處理10、20、30、40、50、60和72 h，每處理重復3個蛾圈，從而篩選最佳條件。

2) HCl 法：滯育卵產后20 h 用HCl 進行處理［室溫25℃，相對密度(比重)為1.100的HCl 溶液浸酸70 min］，用流水洗凈，晾干，各處理均重復3 個蛾圈。

高氧法和HCl 法的‘大造’蠶卵孵化率、孵化時間比較中，調查3個蛾圈。高氧法應用于‘土耳其’蠶卵時，重復15個蛾圈。為了保證材料的準確性，在所有處理取材的過程中，同一蛾圈取一半蠶卵，觀察其滯育性。

1.5.2 蠶卵電鏡掃描高氧法和HCl法處理的‘大造’蠶卵和未處理的滯育卵，在產后的20、48和72 h 及5和9 d 分別取樣，每次取20粒蠶卵，先用1×PBS進行清洗，洗去卵殼表面附著物。采用戊二醛和鋨酸雙固定：取洗凈的蠶卵置于φ為2.5%戊二醛中，4℃條件下固定2 h，然后用1×PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10m in；接著用φ為1%的鋨酸固定2 h，用0.1mol/L的PBS緩沖液漂洗3次，每次漂洗10m in。經過雙固定的樣品，用乙醇和叔丁醇進行梯度脫水，樣品在空氣中自然干燥。干燥好的樣品用導電膠粘貼在掃描電鏡的載物臺上，離子濺射儀鍍膜后用掃描電鏡對蠶卵表面進行觀察。

1.5.3 蠶卵顯微注射 1)以‘大造’品種作為材料，獲取滯育蠶卵：將蠶蛾交配拆對后投放于上漿的蠶粘紙，在黑暗或者弱光的環境中產卵，每間隔1 h收集1次蠶卵，獲得G0代蠶卵并將其置于室溫的環境中保護；

2)將蠶卵用鑷子轉移至用φ為75%的乙醇溶液消毒的載玻片上，排列整齊，取剛搜集的蠶卵用顯微注射儀將1～15 nL、總質量濃度400 ng/μL 的piggyBac空載：pBac［3xp3EGFP］轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，顯微注射在產后2～4 h 內完成，得到轉基因滯育蠶卵；

3)將注射蠶卵在產后20 h 經φ為35%的甲醛蒸汽消毒5m in，置于三氣培養箱，在25℃、RH為75%、密閉條件下，充入φ為70%的氧氣，保持充氧40 h，統計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況，并以未處理的滯育卵為對照。

1.6 統計分析

數據結果用平均值±標準差表示，使用GraphPad Prism 5.0軟件(GraphPad Software Inc.,San Diego,USA)進行統計分析，采用t檢驗比較不同處理組的統計差異。

2 結果與分析

2.1 O2阻斷滯育最佳條件的篩選

2.1.1 O2阻斷滯育最佳濃度的篩選 選擇產后20 h的蠶卵處理40 h，對O2的濃度進行調查。結果表明，φ(O2)為40%、50%、60%、70%和80%時，孵化率在70%以上，φ(O2)為60%、70%和80%時，孵化率在85%以上，其中φ(O2)為70%的處理組出現97.88%的最高孵化率(圖1)。

圖1 不同濃度O2阻斷滯育后的二化性‘大造’蠶卵孵化率Fig.1 The hatching rate of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs under O 2 treatment with different concentrations

2.1.2 O2阻斷滯育最佳時間的篩選 在獲得O2最佳處理濃度(φ為70%)后，對蠶卵產后取樣時間和高氧處理時間進一步調查。結果表明，產后4、12和20 h 取樣的蠶卵，在30、40和50 h 處理時間段里都能取得75%以上的孵化率，其中，產后20 h 取樣的蠶卵在O2處理40 h 后孵化率達到98.67%；數據十分接近的還有產后12 h 取樣的蠶卵，在O2處理50 h 后孵化率達到98.33%，處理時間在30～40 h時孵化率為86.71%～91.13%；產后4 h 取樣的蠶卵在O2處理40 h 后的孵化率達到最高值(86.12%)；而產后32 h 取樣蠶卵的最高孵化率為30.98%，出現在O2處理后40 h；產后48 h 取樣的蠶卵，無論處理10 h，還是72 h 蠶卵都不孵化(圖2)。

根據以上試驗，篩選出O2阻斷滯育(高氧法)的最佳條件為：產后20 h 的蠶卵在φ(O2)為70%條件下處理40 h。

2.2 高氧法和HCl 法的蠶卵孵化率比較

采用φ為70%的O2(高氧法)和HCl 法處理滯育卵，以產后無處理的滯育卵為對照(CK)，比較2種方法阻斷滯育的效果。2種方法處理后10 d 蠶卵的孵化率調查結果見表1。高氧法和HCl法都能較好地阻斷蠶卵滯育。同等條件下，高氧法的效果更好，孵化率為(97±1)%；HCl 法的孵化率為(93±1)%。

圖2 不同產后取卵時間及高氧處理時間的二化性‘大造’蠶卵的孵化率Fig.2 The hatching rate of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs treated after different oviposition time and hyperoxia treating time

2.3 高氧法和HCl 法的蠶卵孵化時間比較

對高氧法和HCl法的蠶卵孵化時間進行了比較(圖3)，以產后無處理的滯育卵為對照(CK)。結果表明，高氧法處理的蠶卵在產卵230 h 開始孵化；到了248 h 孵化率就已經達到了21.9%，但此時的HCl法處理的蠶卵基本才開始有孵化的跡象，2種處理方法的孵化率差異顯著；此后，從產后248 h到260 h，2種方法的的蠶卵孵化率都明顯上升；一直到278 h，高氧法的蠶卵孵化率始終高于HCl 法的蠶卵孵化率。從以上結果可以看出，高氧法的蠶卵孵化開始時間比HCl法的蠶卵早18 h，表明蠶卵在高氧法的處理條件下發育進程快于HCl 法處理的蠶卵。

表1 高氧法和HCl 法處理后10 d 二化性‘大造’蠶卵的孵化率1)Table 1 The hatching rates of bivoltine silkworm ‘Dazao’eggs treated by hyperoxia and HCl after 10 days

圖3 二化性‘大造’蠶卵在不同處理條件下的孵化率Fig.3 The hatching rate of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs under different treatment

2.4 高氧法處理對蠶卵表面刻蝕效果和蠶卵表面氣孔的影響

滯育卵分別用高氧法最佳條件和HCl 法處理，分別在產后20、48和72 h 及5和9 d 取樣,以產后相同時段的無處理滯育卵為對照進行卵殼表面掃描電鏡觀察。結果發現，高氧法和HCl 法剛處理的蠶卵卵殼表面幾乎無變化；48 h 時觀察到蠶卵卵殼表面有較多“脂質”脫落；72 h 時仍然能觀察到“脂質”脫落(圖4)，此后時間點“脂質”脫落迅速減少。而對照中沒有觀察到此現象。

高氧法和HCl 法處理后與對照組比較卵殼表面氣孔大小，最初時差異不大，在48 h 時處理組氣孔開始增大，72 h～9 d(孵化前)期間處理組氣孔進一步增大，而對照組氣孔隨時間逐漸縮小，到9 d 時與處理組形成鮮明對比(圖5)。

2.5 高氧法在一化性家蠶品種上的應用

圖4 高氧及HCl 法處理后不同發育時間的二化性‘大造’卵殼表面掃描電鏡觀察Fig.4 Scanning electron microscopy observation of eggshell surface of bivoltine silkworm‘Dazao’eggs of different developmental time after hyperoxia and HCl treatments

圖5 高氧及HCl 法處理后不同發育時間的二化性‘大造’卵殼表面氣孔掃描電鏡觀察Fig.5 Scanning electronmicroscopy observation of aeropyle surface of bivoltine silkworm‘Dazao’eggsof different development timeafter hyperoxia and HCl treatments

為了了解高氧法阻斷滯育在其他品種的效果，用該方法處理一化性品種‘土耳其’，觀察其孵化效果。結果表明，一化性的品種同樣可以通過高氧法有效阻斷滯育，平均孵化率為(71±20)%(表2)，但是數據方差較大，最高孵化率可以達到98.82%，而最小孵化率則為42.59%，對照全部為滯育卵。

2.6 高氧法在家蠶轉基因上的應用

將高氧處理蠶卵阻斷滯育的方法應用到家蠶轉基因上。經轉基因顯微注射處理后，以產后20 h的注射滯育蠶卵為試驗對象，在φ(O2)為70%的條件下充氧處理40 h，處理后的蠶卵常規催青，約在10 d 后開始孵化，孵化時間為5 d。結果(表3)表明，高氧法處理能有效地阻斷轉基因注射蠶卵滯育，轉青率為(61±14)%，孵化率為(49±9)%，而對照孵化率為0。

表2 高氧法處理一化性‘土耳其’阻斷滯育效果分析Table 2 Analyses of prevention effects of diapause in univoltine silkworm‘Tuerqi’eggsby hyperoxia method

表3 高氧法處理轉基因二化性‘大造’蠶卵阻斷滯育效果分析Table 3 Analysesof prevention effectsof diapause in transgenic bivoltine silkworm‘Dazao’eggsby hyperoxia method

3 討論與結論

滯育是生物體度過困難環境而進化來的一種生存策略。家蠶是典型的卵滯育昆蟲。在生產上，最常用的家蠶卵阻斷滯育的方法是HCl 法，有一半以上的蠶種通過此方法打破滯育[16]。該方法在1877年就有過報道，1916年荒本等人逐漸將該方法轉化為生產工藝應用于蠶業生產[17]，為人類蠶絲業的發展做出了重要的貢獻。關于高氧法阻斷滯育最早的報道幾乎與HCl 法在同一個時代[17]，20世紀70—80年代少數日韓研究者圍繞卵殼通透性、蠶卵呼吸率等問題展開了研究[5，18]，此后便鮮有相關研究報道。高氧法之前未能應用于生產實踐，可能是當時的試驗條件未能達到生產上的要求或各種儀器試劑的限制，不利于在生產上廣泛推廣使用，或者生產成本偏高。但是，在科技高度發達的今天，環境友好成為了經濟發展的前提條件，蠶種場大量使用HCl將逐漸受到限制，因此轉而使用更為環保、綠色的方法勢在必行。高氧法作為阻斷滯育的方法，取樣時間和處理時間都比較寬泛，使用密閉的培養箱或容器就可以實現，操作較簡單、安全，技術人員也容易掌握。

家蠶滯育機理的研究具有科學和產業上的雙重重要性，因此受到人們普遍關注。但是，由于影響因素眾多且是獨特的跨帶傳遞方式，比較復雜，滯育機理和阻斷滯育機理至今仍不十分清楚。在前期研究中，發現高氧法和HCl 法處理后獲得的差異基因均在氧化還原功能上富集，并且表達模式趨同，推測其阻斷滯育的機制相似[19]。在隨后的掃描電鏡觀察中發現HCl法處理后的蠶卵表面有“脂質”脫落物出現，蠶卵氣孔隨著發育逐漸增大[20]，本文中高氧法處理的蠶卵也出現同樣的現象，推測這是蠶卵胚胎從滯育轉而發育的表現之一。

在家蠶轉基因研究使用的品種中，二化性家蠶品種經濟性狀優異，不存在保種困難的問題，且已經大量用于蠶業生產，如果使用二化性品種作為家蠶轉基因的受體材料，在轉基因蠶的推廣上將極具優勢。然而，二化性家蠶品種用于轉基因研究和應用，最重要且最需要解決的問題就是阻斷滯育，使之能夠連續飼養。目前，低溫催青法耗時長，需要超過1個月的時間，且還需要反季節飼養[21-22]，這些問題無疑都增加了制備轉基因家蠶的難度；而早浸酸法由于浸酸時間過早、脫酸不凈等原因影響轉基因注射后蠶卵的轉青率和孵化率，并且最佳注射時間與浸酸時間沖突[13-14]，達不到實際科研生產要求。高氧法應用于轉基因二化性家蠶蠶卵阻斷滯育，處理注射后的轉基因蠶卵，其平均孵化率為(49±9)%，遠高于非滯育的多化性蠶品種的孵化水平，與低溫催青處理的蠶卵孵化率持平[15]，但是高氧法突出優點是用時短，飼育簡單。高氧法在轉基因家蠶蠶卵制備上的應用為阻斷轉基因家蠶卵滯育提供了一種高效簡便的方法，有利于轉基因技術創造出各種性狀優良的新的特殊的家蠶品種。

綜上所述，本文中高氧法不僅能較好地對二化性蠶品種阻斷滯育，而且將該處理條件應用于一化性蠶品種，也取得了不錯的孵化效果，說明高氧法阻斷滯育是可行的，不局限于某種蠶品種。另外，高氧法是在常溫常壓下進行的，與傳統HCl 法相比操作簡單，易于掌握，孵化時間短，適合向普通蠶農推廣。在基礎研究領域中，該方法更能發揮其特有優勢，顯著縮短轉基因家蠶培育時間，突破了轉基因家蠶的技術障礙，為家蠶轉基因研究注入新活力。當然，在生產上推廣該方法還需要更多品種、更大范圍的進一步調查，開發適合于生產上使用的相關設備或者工藝條件是我們下一步需要研究的內容。