酶法合成氨芐西林時酶與懸浮液的分離研究

黃國明，王欣，嚴正人，張海燕，魏士倩

（1.華北制藥集團先泰藥業有限公司，石家莊 052165；2.河北省半合青類相關酶及應用技術創新中心，石家莊 052165）

氨芐西林（Ampicillin），是一種β-內酰胺類抗生素，具有良好的抗菌效力和較低的毒副作用，在臨床治療中有著廣泛的應用[1]。該藥列于世界衛生組織基本藥物標準清單，為基礎公衛體系必備藥物之一。氨芐西林的傳統合成方法是把母核和側鏈經過化學合成得到。近年來，由于綠色生產的需求，在水相中用固定化青霉素G ?；福≒enicillin G acylase，PGA）催化合成氨芐西林已經成為工業化生產氨芐西林的發展趨勢而被廣泛采用。

酶法合成氨芐西林的機理為：在PGA 催化下，底物6-APA與側鏈PGM·HCl 反應生成氨芐西林（Ampicillin，合成反應Ⅰ），但同時，還有底物水解（PGM·HCl，反應Ⅱ）和產物水解（Ampicillin，反應Ⅲ），所有這些副反應（反應Ⅱ和反應Ⅲ）均會產生D-苯甘氨酸（PG）[2]。

圖1 氨芐西林的酶法合成Fig.1 Enzymatic synthesis of ampicillin

酶法合成抗生素工藝在工業生產時，PGA的分離再生是關鍵技術之一，如果分離困難會導致生產工時的不可控制，影響后續工序的進行，最終影響產品收率和質量[3-4]。目前對酶法合成抗生素的研究主要集中在合成工藝優化及母液的回收[5-12]，對PGA與懸浮液分離過程的研究較少[13-17]。本試驗室發現在酶法合成氨芐西林時，在機械攪拌力的作用下將PGA與懸浮液過篩網，目的是使懸浮液通過篩網，而PGA截留在篩網上面重復利用。但是在實際操作時，存在PGA與懸浮液難以分離的突出問題。本文敘述了采用一種直觀、快速檢測PGA與懸浮液分離速率的方法，分別從PGA 應用的角度、反應副產物、工藝條件三個方面，即PGA用量、PGA粒度、D-苯甘氨酸（D-phenylglycine，PG）的量、反應溫度、反應濃度、在酶反應階段加入晶種[18～20]對影響PGA與懸浮液分離速率的諸因素進行了考察，從而確定氨芐西林懸浮液分離速率為最合適試驗條件，對產業化生產具有指導意義。

1 試驗材料和儀器

1.1 試驗材料

6-氨基青霉烷酸（6-Aminopenicillinic acid，6-APA）由珠海聯邦制藥股份有限公司提供、D-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽（D-phenylglycine methyl ester hydrochloride，PGM·HCl）由河北省化學工業研究院提供、PGA 由湖南福來格生物技術有限公司提供。

1.2 試驗儀器

電動攪拌器（德國IKA 公司，RW20D）、臺式pH計（瑞士梅特勒-托利多公司，FiveEasy Plus）、生物顯微鏡（上海繪統光學儀器有限公司，XSP-9C）、循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司，SHB-Ⅲ）、PGA 分離器（自制，120 目篩網）。

2 試驗方法

酶法制備氨芐西林成品的工藝參考以下步驟[21]：（1）將6-APA、PGM·HCl與PGA混合于水中，得混合液；（2）用酸或堿調節控制混合液的pH值，在一定溫度下進行反應，待反應完全后，分離PGA與氨芐西林懸浮液；（3）將含有氨芐西林粗品的反應液用酸溶清，再用堿結晶，養晶，洗滌，干燥，得氨芐西林產品。

PGA與懸浮液分離速率的檢測方法如下：將PGA 分離器（120 目篩網）安裝在做好刻度標識的燒杯上，將攪拌槳安裝在PGA 分離器內，開啟攪拌，攪拌速度為45 r/min。將反應終點的料液全部倒入PGA 分離器中計時，在攪拌作用下含有氨芐西林粗品的料液透過篩網滴落到下面的燒杯中，記錄不同時間對應的燒杯中料液體積。

本試驗室采用的PGA與懸浮液分離速率的檢測方法直觀、快速，此方法同樣適用于其他酶法合成抗生素時PGA與懸浮液分離速率的檢測。

2.1 考察PGA 對分離速率的影響

2.1.1 考察PGA用量對分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應溫度20℃，加入不同重量的PGA 開始反應，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時為反應終點，停止反應。將PGA 催化合成到達反應終點的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。初始PGA 量為20 g，以初始PGA 量的2～3倍進行催化合成氨芐西林，即分別加入20 g、40 g、60 g PGA。

2.1.2 考察PGA粒度對分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA 、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應溫度20℃，加入不同粒度PGA（大粒度PGA粒徑為300～600 μm，小粒度PGA粒徑為300～400 μm）開始反應，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時為反應終點，停止反應。將PGA 催化合成到達反應終點的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

2.2 考察反應副產物對分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應溫度20℃，加入20 g PGA開始反應，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA殘留濃度低于10 mmol/L 時為反應終點，在反應終點加入不同重量的PG 攪拌10 min后，將氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。PG 用量分別為0 g、0.2 g、0.4 g、0.6 g。

2.3 考察不同工藝條件對分離速率的影響

2.3.1 考察反應溫度對分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，分別控制反應溫度為10℃、20℃、30℃，加入20 g PGA 開始反應，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA 殘 留濃 度 低于10 mmol/L時為反應終點，停止反應。將PGA 催化合成到達反應終點的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

2.3.2 考察反應濃度對分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應溫度為20℃，加入20 g PGA 開始反應，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時為反應終點，停止反應。將粗品分離后配制不同濃度的PGA與懸浮液，測定PGA與懸浮液的分離速率。

2.3.3 考察加入晶種對分離速率的影響

在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應溫度為20℃，加入20 g PGA 開始計時，在反應5 min 時加入5%氨芐西林晶種，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時為反應終點，停止反應。將PGA 催化合成到達反應終點的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

3 結果與討論

3.1 從PGA 角度研究對分離速率的影響

3.1.1 PGA用量對分離速率的影響

不同PGA用量對分離速率的影響結果見圖2，隨著PGA 量的增加，單位時間內懸浮液過濾量明顯增加；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序為：3倍酶量＞2倍酶量＞對照，分析原因可能是增大PGA量，提高了PGA與懸浮液的接觸面積，使反應體系黏度降低，從而提高了PGA與懸浮液的分離速率。同時提高PGA用量后酶法氨芐西林重量收率都在160%以上，與對照批重量收率161%相當，結合成本，酶量為40 g 較為適宜。

圖2 不同PGA用量合成氨芐西林時過濾體積隨分離時間的變化Fig.2 The change of filtration volume with separation time in the synthesis of ampicillin with different PGA dosages

3.1.2 PGA粒度對分離速率的影響

在相同PGA活性前提下，使用不同粒度PGA合成氨芐西林。不同PGA粒度對分離速率的影響結果見圖3，合成氨芐西林時PGA粒度增大1.5倍左右，PGA與懸浮液分離速率無明顯改變；以分離70 mL懸浮液的速率大小排序為：小粒度PGA合成氨芐西林的時間≈大粒度PGA合成氨芐西林的時間，說明在相同PGA活性的前提下，改變PGA粒度，并不能提高PGA與懸浮液分離速率，所以PGA粒度不是影響PGA與懸浮液分離速率的關鍵因素。

圖3 不同粒度PGA合成氨芐西林時過濾體積隨分離時間的變化Fig.3 Change of filtration volume with separation time in the synthesis of ampicillin by PGA with different particle sizes

3.2 反應副產物PG對分離速率的影響

結合圖1和前期試驗數據，可知反應過程中副產物PG 在料液中析出，可能會使體系變得黏稠。故考察反應副產物PG對PGA與懸浮液分離速率的影響。當酶合成工藝路線固定時，生成的PG 量相對固定，所以本試驗在反應終點已經生成一定量PG的基礎上，通過加入不同重量的PG 來考察其對PGA與懸浮液分離速率的影響。反應副產物PG對分離速率的影響結果見圖4，隨著PG 量的增加，PGA與懸浮液分離速率下降。以分離50 mL 懸浮液的速率大小排序為：PG 加入量0 g ＞PG 加入量0.2 g ＞PG 加入量0.4g ＞PG 加入量0.6 g。分析原因可能是PG的存在，導致料液黏度較大，不易與PGA 分離，從而影響PGA與懸浮液的分離速率。說明降低PG 量可以提高PGA與懸浮液的分離速率。

3.3 從工藝條件研究對分離速率的影響

3.3.1 不同反應溫度對分離速率的影響

圖4 反應液中加入不同數量PG 時過濾體積隨分離時間的變化Fig.4 Change of filtration volume with separation time when different amounts of PG are added to the reaction liquid

不同反應溫度對分離速率的影響結果見圖5，隨著溫度的升高，PGA與懸浮液的分離速率下降；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序為：反應溫度10℃、20℃、30℃。結合3.2 部分PG 量對PGA與懸浮液分離速率的影響，分析原因可能是降低反應溫度后，降低了反應副產物PG的生成量，從而提高了PGA與懸浮液的分離速率。同時在10℃和20℃時制備的酶法氨芐西林重量收率均在160%以上，與對照批重量收率161%相當，而溫度30℃制備的酶法氨芐西林重量收率低于160%，所以反應溫度采用10℃較為適宜。

圖5 不同反應溫度時過濾體積隨分離時間的變化Fig.5 Change of filtration volume with separation time at different reaction temperatures

3.3.2 不同反應濃度對分離速率的影響

不同反應濃度對分離速率的影響結果見圖6，隨著氨芐西林反應濃度降低，PGA與懸浮液分離速率增大；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序為：1/2氨芐西林料液濃度＞2/3 氨芐西林料液濃度＞3/4 氨芐西林料液濃度＞初始氨芐西林料液濃度。結合3.2部分PG 量對PGA與懸浮液分離速率的影響，分析原因可能是降低反應濃度后體系中PG 量也降低，從而提高了PGA與懸浮液的分離速率。同時3/4 氨芐西林料液濃度時制備的酶法氨芐西林重量收率在160%以上，與對照批重量收率161%相當，而2/3氨芐西林料液濃度及1/2 氨芐西林料液濃度時制備的酶法氨芐西林重量收率降至160%以下。說明降低反應濃度可以提高PGA與懸浮液的分離速率，但是會降低收率。

圖6 不同反應濃度時過濾體積隨分離時間的變化Fig.6 Change of filtration volume with separation time at different reaction concentrations

3.3.3 加入晶種對分離速率的影響

在酶反應階段加入PGA后，隨著反應的進行，氨芐西林晶體析出，本試驗考察在氨芐西林晶體析出前加入晶種對PGA與懸浮液分離速率的影響。加入晶種對分離速率的影響結果見圖7，在酶反應階段加入晶種與不加入晶種相比，PGA與懸浮液的分離速率明顯提高；以分離70 mL 懸浮液的速率大小排序為：平行試驗1 ≈平行試驗2 ≈平行試驗3 ＞對照批，分析原因可能是加入晶種后誘導析晶，改善了氨芐西林晶型，使氨芐西林晶體容易與PGA 分離。同時這三批平行試驗制備的酶法氨芐西林重量收率都在160%以上，與對照批重量收率161%相當，說明晶種的加入可以提高PGA與懸浮液的分離速率。

3.3.4 確定優化工藝

綜合以上的研究結論，確定優化工藝條件為：增加酶量、降低反應溫度、在酶反應階段加入晶種的協同作用。

優化組合工藝參數為：在四口瓶中加入18 g 6-APA、18 g PGM·HCl、150 mL 純化水，控制反應溫度10℃，加入40 g PGA 開始反應，在反應5 min時加入5%氨芐西林晶種，控制反應過程中pH為5.0～7.5，當6-APA 殘留濃度低于10 mmol/L 時為反應終點，停止反應。將PGA 催化合成到達反應終點的氨芐西林懸浮液倒入PGA 分離器，測定PGA與懸浮液的分離速率。

圖7 酶反應階段加入晶種時過濾體積隨分離時間的變化Fig.7 Change of filtration volume with separation time when adding crystal seeds in enzyme reaction stage

圖8 優化組合時酶分離速率曲線Fig.8 Rate curve of enzyme separation in optimal combination

由圖8可知，酶量40 g、反應溫度10℃、在酶反應階段加入晶種的協同作用可以極大程度地提高PGA與懸浮液分離速率。

4 結論與展望

通過從PGA 應用的角度、反應副產物、工藝條件三個方面對PGA 催化合成氨芐西林過程中PGA與懸浮液分離速率的影響因素進行研究，得出：增加酶量、降低反應溫度、在酶反應階段加入晶種的協同作用可以極大程度地提高PGA與懸浮液分離速率。

PGA與懸浮液的分離速率高，在工業生產時有兩大優勢：一是將PGA 快速地從料液中分離出去，避免PGA的失活；二是使生產工時得到有效地控制，減少料液的降解，保證了產品收率和質量。這不僅為酶法合成氨芐西林的產業化生產提供有力的支持，也為酶法合成其他抗生素時PGA與懸浮液分離研究提供了方向。