周圍神經損傷修復過程以及miRNA在周圍神經修復中的研究進展

蔣玲麗，魏在榮

(遵義醫科大學附屬醫院 燒傷整形外科， 貴州 遵義 563099)

據統計，全球每年因車禍傷、機器絞傷等導致周圍神經損傷的患者數量高達百萬，且發病率有逐年上升的趨勢[1]。周圍神經損傷(Peripheral nerve injuries，PNI)導致其支配區域的感覺及運動功能喪失，嚴重影響了患者的生活質量。截至目前，臨床上治療PNI的方法主要有神經斷端吻合術、自體神經轉位或移植術、神經套接管、組織工程材料、干細胞治療以及促神經生長因子注射治療等。由于神經顯微吻合術后易形成吻合口瘢痕或吻合不佳導致神經斷端神經瘤形成，神經套接管以及組織工程材料價格昂貴、組織相容性不佳、療效不確定等因素，目前臨床修復神經缺損最佳的治療方式仍然是自體神經轉位或移植，但是自體神經來源有限且神經供區并發失神經癥狀，所以，目前已有的治療方法在臨床仍存在很大應用局限性[2-5]。所以，在臨床工作中迫切于尋找一種新的有效的周圍神經修復方案。

PNI再生是一個十分復雜的過程，隨著對周圍神經損傷修復機制研究的不斷深入，發現PNI修復再生過程受到諸多關鍵因子及通路的調控，而了解這些因素的調控機制就很可能找到新的臨床治療靶標，通過干預調控因素從而加速周圍神經修復再生。因此，研究PNI修復過程中關鍵調控因子及其調控機理，針對神經修復機制開發新型藥物，對提高PNI治療效果及改善患者的生存質量具有重要意義。

1 PNI修復再生過程

PNI再生主要經歷了神經斷端華勒變性、修復雪旺細胞形成和“神經橋”形成三個重要過程(見圖1)。

圖1 PNI主要修復過程及miRNA的調控作用

1.1 華勒變性 華勒變性是PNI修復再生的基礎[6]。周圍神經損傷后不久，神經遠節斷端由于喪失胞體營養支持而變性、解體，髓鞘及軸突破壞，即發生華勒變性。此時清除損傷部位的髓鞘及軸突碎片刻不容緩，順利清除髓鞘及軸突碎片可以為軸突再生創造合適的微環境，而碎片清除不佳則可能觸發炎癥性免疫反應，從而損害神經元以及延緩軸突再生過程。在華勒變性過程中，神經斷端雪旺細胞 (Schwann cells,SC)將在分子及細胞水平發生廣泛的變化，產生獨特的表型，即形成修復雪旺細胞[7]。修復雪旺細胞是一種具有較強再生能力的祖細胞樣細胞，主要有維持受損神經活性、支持神經再生等功能[8-10]。修復雪旺細胞形成后通過在局部以引發髓鞘自噬、募集巨噬細胞等方式清除髓鞘及軸突碎片[8]，聯合損傷部位的巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞等形成引導軸突再生的“神經橋”(Bungs of Büngner)，引導軸突重新支配靶目標同時表達諸多關鍵的再生相關細胞因子，例如神經元生長因子(Neuronal growth factors)和細胞粘附因子(Cell adhesion molecules)[8,11]，為軸突再生創造適宜的微環境。

1.2 修復雪旺細胞形成 修復雪旺細胞的形成受諸多機制的調節，主要是與髓鞘形成相關基因的下調和損傷特異性基因表達程序的上調。未成熟的雪旺細胞向有髓細胞的轉化取決于前髓鞘素基因調節蛋白(Promyelin gene regulatory proteins)，包括Krox-20、Nab1和2、Oct-6、Brn2、NFκB和Sox-10等，而雪旺細胞髓鞘化主要取決于鋅指轉錄因子Krox-20(Egr2)和其他一些軸突信號激活的前髓磷脂轉錄因子[12-15]。髓鞘形成的雪旺細胞有很強的可塑性，在神經受損或者發生脫髓鞘病變時，它可以去分化為祖細胞樣細胞，在此過程中，亮氨酸拉鏈蛋白c-Jun作為主要調控者[13]。在正常生理過程中，c-Jun通過Krox-20或環磷酸腺苷(cAMP )抑制髓磷脂基因的活化，當神經損傷時，c-Jun和Krox-20表現出交叉拮抗功能關系，調控有髓雪旺細胞去分化為祖細胞樣細胞[10]。c-Jun存在于未成熟的雪旺細胞中，其表達被Krox-20抑制，而在共培養過程中過表達c-Jun時髓鞘化受到抑制，因此在雪旺細胞開始髓鞘化時c-Jun的表達水平很低。PNI后雪旺細胞去分化重新進入細胞周期，c-Jun及磷酸化c-Jun的表達迅速上調，雪旺細胞表現為去分化及增殖；而當外源性使用db-cAMP誘導雪旺細胞髓鞘化時，c-Jun和磷酸化c-Jun被抑制[16-17]。所以在周圍神經損傷修復過程中，c-Jun首先上調以促斷端SC去分化為祖細胞樣細胞并增殖，隨著修復進程的進行，c-Jun下調，而Krox-20等促雪旺細胞髓鞘化因子開始上調，促雪旺細胞髓鞘化進而促進PNI修復。

1.3 “神經橋”形成 在“神經橋”形成前，兩斷端之間神經碎片的清除十分必要，而巨噬細胞在這個過程中扮演著“清道夫”的作用，主要功能是參與髓鞘及軸突碎片的清除，促進神經橋形成。PNI后，局部微環境缺氧刺激以及去分化SC募集到損傷局部的巨噬細胞聯合局部常駐巨噬細胞[18]對PNI迅速做出反應[19-21]。CCL2是單核細胞的主要趨化因子，它與受體CCR2以高親和力結合[22-23]，在神經中，CCL2主要在雪旺細胞中表達，CCR2主要在單核細胞和巨噬細胞表達，而巨噬細胞和嗜中性粒細胞在清除髓磷脂和軸突碎片中起主要作用[24]。神經損傷后，在損傷局部檢測到CCL2 mRNA增加，隨后在整個神經遠端殘根中高表達，隨著雪旺細胞高表達CCL2，巨噬細胞不斷被募集到損傷局部，并于3天左右達到峰值。巨噬細胞對髓磷脂的吞噬清除主要是調理素途徑CR3(補體受體3)和非調理素途徑SRA(清道夫受體-AI / II)[6]：變性的髓磷脂激活補體系統后產生補體蛋白C3bi后，CR3可通過C3bi與C3bi調理過的髓磷脂結合，從而清除變性的髓磷脂，而SRA作為非調理素受體，可直接結合未經調理的髓磷脂對髓磷脂進行清除。據近期研究，CX3CR1依賴性巨噬細胞浸潤到損傷神經中，釋放出含有可產生活性氧的酶的外泌體，神經元軸突內吞并將這些外泌體逆行轉運至神經膠質，在神經元細胞體釋放出活性氧，這些分子氧化并使磷酸酶和緊張素同源物(PTEN)失活，從而激活磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信號通路(Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway)，由此促進周圍神經的再生[25]。另外，在秀麗隱桿線蟲中，在巨噬細胞上表達基因ced-1(ced代表細胞死亡異常)編碼一種跨膜清除劑受體(該受體在無脊椎動物和脊椎動物之間高度保守)，當死亡細胞或軸突碎片發出吞噬信號時，巨噬細胞表面受體激活后啟動信號通路對軸突碎片等“垃圾”進行清除[26]。

PNI后神經兩斷端之間形成的“神經橋”(“Bungs of Büngner”)是引導軸突再生重新支配靶組織的橋梁。PNI后，神經斷端SC去分化為祖細胞樣細胞，發出信號募集血液中巨噬細胞至損傷部位，同時局部常駐巨噬細胞激活，巨噬細胞感受到損傷局部的缺氧信號。在PN橫斷第2天左右，損傷部位巨噬細胞(50%)和嗜中性白細胞(24%)以及成纖維細胞(13%)和內皮細胞(ECs)(5%)初步形成一個半透明的“神經橋”[19]。巨噬細胞分泌的VEGF-A誘導形成的極化血管是周圍神經再生過程中引導SC及軸突準確重支配靶目標的基礎[27]。為了緩解局部缺氧，神經橋巨噬細胞的轉錄因子HIF-1α表達增加并啟動轉錄反應，上調促血管生成因子(例如VEGF-A)，而VEGF是ECs強烈有效的引誘劑，故橋中巨噬細胞通過分泌VEGF-A，能夠使ECs聚集到兩神經斷端，觸發神經橋區域的血管極化，進而形成神經橋極化血管內皮支架，該支架可以引導雪旺細胞索從神經殘端以“出芽”的方式爬出，并有方向性的穿過神經橋。研究證實TGFβ信號傳導與SC增殖、凋亡和髓鞘形成的調節有關[28]，在雪旺細胞沿神經橋遷移過程中，TGFβ通過上調EphB2而介導EphB2效應物N-鈣粘蛋白(它也是TGFβ靶標)的表達，從而使雪旺細胞索能沿著神經橋定向移動，而在缺乏TGFβ信號傳導的情況下，N-鈣粘蛋白表達降低將會導致SC索及其伴隨再生的軸突混亂遷移，導致周圍神經修復重建失敗。雪旺細胞索沿神經橋爬行后形成一個中空的管腔，再生軸突沿著這條管腔再生，最終準確重支配其靶目標。

2 miRNA在PNI修復中的作用

miRNA在PNI修復過程中發揮著重要的調控作用[29](見圖1)。研究發現PNI后miR-340通過直接靶向組織纖溶酶原激活劑(tPA，有降解基質分子和細胞粘附分子的能力)的3'-UTR以調控tPA的表達，從而調節細胞碎片的清除及軸突再生[30]。PNI后軸突或神經末梢分泌出大量miRNA指導雪旺細胞的遷移， miR-9，miR-221，miR-222和miR-182可以調節SC的增殖和遷移，其中miR-221-3p通過下調SCs髓鞘形成所必需的NGF1-A結合蛋白1(Nab1)，抑制SCs髓鞘形成而促進SCs的增殖及遷移[31]；miR-221 / 222可顯著促進PNI后髓鞘再生過程以促進神經再生[32]。PNI后周圍神經miR-222通過部分沉默PTEN的表達進而促進DRG神經元的神經突向外生長[33]；Let-7 miRNA通過直接靶向神經生長因子(NGF)并抑制其蛋白翻譯，從而顯著降低SCs的細胞增殖和遷移，而在PNI的早期應激反應中let-7 miRNA通過非NGF依賴途徑抑制SC凋亡[34]。miR-138是神經系統中高度表達的miRNA，其作為分子阻遏物來調節發育和再生過程中軸突的生長，而NAD依賴的組蛋白脫乙?；?HDAC)SIRT1為miR-138下游的分子靶標，SIRT1又作為轉錄阻遏物直接抑制miR-138的表達從而促進哺乳動物軸突再生，故miR-138和HDAC SIRT1之間形成相互負反饋的回路調控軸突再生過程[35]。miR-192-5p抑制作用通過上調X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的表達，減少神經細胞凋亡并增加神經修復因子的表達以促進周圍神經損傷的修復和再生[36]。PNI后上調miR-sc14可以促進雪旺細胞的增殖和遷移，所以有研究提出miR-sc14可能是促進周圍神經損傷修復的干預靶標[37]。

3 外泌體miRNA在PNI修復中的作用

近年來，越來越多研究表明外泌體在細胞間通訊中起到關鍵作用，外泌體[38-40]及其內富含的miRNA參與調控多種細胞途徑，包括血管生成，細胞轉運，細胞凋亡等過程[41-42]。研究表明外泌體攜帶的miRNA在神經修復過程中發揮著重要的作用[43](見圖2)。在PNI修復過程中，微環境中的雪旺氏細胞、巨噬細胞和間充質干細胞(Mesenchymal stromal cells，MSCs)等細胞會通過外泌體攜帶的miRNA加速周圍神經損傷修復，促進周圍神經功能恢復[43-44]。研究發現雪旺氏細胞外泌體miR-340可以調控損傷的神經碎片清除和軸突再生[30]；而miR-221/222在周圍神經修復過程中可以通過靶向LASS2基因調控雪旺氏細胞的遷移和增殖，并誘導雪旺氏細胞表型改變[45]。M2型巨噬細胞外泌體miR-223通過上調神經生長因子和層粘連蛋白表達促進雪旺氏細胞遷移和增殖，進而加速周圍神經修復[46]。MSCs外泌體miR-17-92簇通過調控PTEN/mT1OR通路促進軸突生長，并且可以增強神經可塑性和功能恢復[47-48]；多能間充質干細胞外泌體miR-133b可以提高神經可塑性和功能恢復[49-50]；經LPS預處理的MSCs外泌體let-7b通過TLR4/NF-κB/STAT3/AKT信號通路調節炎癥反應并激活M1型巨噬細胞[51],促進神經損傷部位血管生成,從而加速“神經橋”的建立。

圖2 外泌體miRNA在PNI修復中的作用

4 展望

盡管顯微外科及神經移植等修復PNI的方法可以恢復周圍神經的連續性，但神經功能的恢復效果仍然不盡如意，PNI的治療依舊是臨床的棘手問題。PNI修復再生是一個多因素多通路調控的過程，miRNA及外泌體包含的miRNA在這個過程中發揮著復雜重要的作用，更加深入的探討PNI修復機制，據修復過程的關鍵靶點研發新型藥物以干預神經修復過程，例如使華勒變性順利完成、促進雪旺細胞去分化為修復雪旺細胞、促修復雪旺細胞增殖遷移、促進神經生長相關因子表達以及加速軸突再生等，是將來治療PNI的新方向，值得繼續深入研究。