食品中真菌毒素樣品前處理方法的研究進展

胡文堯, 龍美名, 胡玉斐, 李攻科

(中山大學化學學院, 廣東 廣州 510275)

真菌毒素是由真菌在一定環境條件下產生的一類具有毒性的小分子次級代謝產物[1,2],不僅可以通過抑制人體細胞內相關蛋白質和酶的合成來損害神經系統、免疫系統,以及肝臟、腎臟、腸胃等組織器官,而且還具有致癌、致畸、致突變等作用,當攝入量超過一定限量時,直接危及生命[3-6]。真菌種類繁多,由它們產生的毒素類型也較多,截至目前,已發現500多種化學結構各異的真菌毒素[7,8],其中黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)、赭曲霉毒素(ochratoxins, OTs)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)、伏馬菌毒素(fumonisins, FBs)、展青霉毒素(patulin, PAT)等因其毒性強、污染頻率高,受到廣泛關注[9-11]。根據化學結構的不同,真菌毒素主要可以分為剛性共面苯環結構(如AFs)、部分共面結構(如赭曲霉毒素A(OTA))和非共面倍半萜烯結構(如單端孢霉烯族鐮刀菌毒素(T-2毒素))3大類[12]。

表 1 中國、歐盟和美國關于常見真菌毒素的限量標準Table 1 Limit standards for mycotoxins in China, European Union (EU) and the United States of America (USA)

真菌毒素污染范圍廣,易污染糧食作物及其制品、油料作物及其制品、堅果產品、蔬菜、水果和乳類制品等多種食物,以及在這些食物的種植、采收、運輸、加工和存儲等過程中均有可能受到真菌毒素的污染[13-15]。而大部分真菌毒素在常規的食品加工和烹飪過程中均無法將其消除[16,17],一旦食用含有這些真菌毒素的食品,可導致人體中毒,從而引發嚴重的后果[18]。因此,包括我國在內的許多國家都制定了針對真菌毒素的嚴格限量標準[19,20],以保障食品安全和消費者生命健康安全。我國于2017年實施了最新的食品中真菌毒素限量標準《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》[21],對黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等常見真菌毒素進行了限量規定。表1為中國、歐盟及美國規定的常見真菌毒素在不同類食品中的限量標準。

圖 1 2009～2019年發表的關于食品中真菌毒素樣品 前處理文獻的數量Fig. 1 Number of publications on preparation methods for mycotoxins in food samples during 2009-2019 Source: Web of Science and CNKI; keywords: mycotoxins, sample pretreatment or sample preparation.

圖 2 2009～2019年發表的關于食品中真菌毒素常用 樣品前處理方法的文獻分布Fig. 2 Distribution of literatures of different preparation methods for mycotoxins in food samples published during 2009-2019 LPE: liquid phase extraction; LPME: liquid phase microextraction; SPME: solid phase microextraction; FAE: field assist extraction; IAC: immunoaffinity chromatography.

圖 3 食品中主要真菌毒素的樣品前處理和分析檢測方法Fig. 3 Preparation methods and analytical methods for mycotoxins in foods AFs: aflatoxins; OTs: ochratoxins; FBs: fumonisins; LLE: liquid liquid extraction; MSPD: matrix solid phase dispersion; UAE: ultrasound-assisted extraction; MAE: microwave-assisted extraction; ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay; FIA: fluorescence immuno assays; ICA: immuno chromatography assay; ISA: immunosensor assay.

目前,食品中真菌毒素的檢測方法主要可以分為兩大類,一類是以色譜法、色譜-質譜法為代表的分析方法,這類方法靈敏度高,準確性好,能夠對真菌毒素精確定量,但樣品前處理過程復雜,耗時較長,如高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜法(LC-MS)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)等;一類是以免疫學分析方法為基礎的快速分析技術,如酶聯免疫分析法(ELISA)、免疫層析分析(ICA)、熒光免疫分析法(FFIA)、免疫傳感分析(ISA)等,具有耗時短、檢出限低等優點,但存在假陽性較高、重復性較差等缺點[22,23]。真菌毒素種類繁多,結構差異較大,含量跨度范圍廣,樣品基質形態多樣且干擾物多,這些因素制約著樣品中真菌毒素的直接分析[24,25]。因此,針對不同目標、不同基質的真菌毒素,選擇合適的樣品前處理技術,達到分離富集待測物,消除基質干擾的目標,已成為近年來食品中真菌毒素分析的研究熱點。如圖1所示,2009～2019年10年間食品中真菌毒素樣品前處理相關文獻發表數量總體呈上升趨勢,從2014年開始增長速度明顯加快。目前,基于磁性納米材料(MNPs)、分子印跡聚合物(MIPs)、石墨烯類材料(GR)、免疫親和材料、適配體功能材料等新型分離介質而發展起來的高效樣品前處理技術如固相萃取、固相微萃取、磁性固相萃取、超聲輔助提取、免疫親和層析和QuEChERS法等在食品真菌毒素樣品前處理中的應用越來越多[15,26]。圖2為2009～2019年間食品中真菌毒素不同樣品前處理技術相關文獻的發表情況。從圖2中可以看出,固相萃取技術和液相萃取技術在食品真菌毒素樣品前處理中應用較多,發展也較為成熟,能夠適用于多種食品基質的前處理。圖3簡要描述了食品中主要真菌毒素的種類、常用樣品前處理介質和技術,以及分析檢測方法。本文對此詳細綜述了近幾年來國內外食品中真菌毒素樣品前處理方法的研究進展,以期為該領域的進一步研究提供參考。

1 樣品前處理介質

在樣品前處理過程中,介質通?？蓪崿F對目標物的富集提取,比如液體溶劑和固體材料,液體溶劑中水和有機溶劑應用較多,也較為傳統,而固體介質種類較多,通常具有較大比表面積、多孔結構、超順磁性、特異性識別等特點,其在食品樣品前處理過程中發揮著重要作用。目前在食品真菌毒素樣品前處理過程中常用的固體介質主要有納米材料(如磁性納米材料和石墨烯類材料等)、聚合物材料(如分子印跡聚合物材料等)和生物材料(如適配體功能化材料、免疫親和材料等)。

1.1 納米材料

納米材料以其獨特的物理化學性能,在很多領域都有著廣泛應用,在食品真菌毒素樣品前處理領域應用較多的納米材料主要有磁性納米材料、石墨烯材料、碳納米管等。磁性納米材料以其較大的吸附容量、較好的超順磁性、較強的穩定性、易于分離、可以重復使用等優點,已逐漸應用于食品真菌毒素樣品前處理過程中[27,28],而常用的磁性基礎介質主要為鐵的氧化物(Fe3O4)、鐵合金(Fe-Co)、鐵氧體(CoFe2O4)等鐵磁性化合物[29]。Hu等[30]制備了一種氯化十六烷基吡啶(CPC)修飾的Fe3O4磁性納米微球Fe3O4-SiO2NPs@CPC,用于水樣中赭曲霉毒素A的分離富集,對赭曲霉毒素A的吸附能力可達5.95 mg/g,優于傳統的固相萃取吸附材料。Manafi等[31]制備了一種乙二醇雙巰基乙酸酯-正硅酸乙酯-四氧化三鐵復合磁性納米粒(EGBMA-TEOS-MNPs),對小麥樣品中黃曲霉毒素進行萃取富集,富集因子為97,對黃曲霉毒素具有較好的富集效果。Qian等[32]開發了3種磁性納米復合材料,磁性N-乙烯基吡咯烷酮納米粒(MDN@Fe3O4)、3-N,N-二乙氨基修飾磁性納米粒(PSA@Fe3O4)和二氧化鋯修飾磁性納米粒ZrO2@Fe3O4,用于分散固相萃取飼料中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A等13種真菌毒素,重復使用5次,回收率依然能保持80%以上。石墨烯材料、碳納米管等新型碳納米材料具有較大比表面積、較強吸附能力、易于功能化修飾和可重復使用等特點,在食品真菌毒素樣品前處理中已有部分應用。Yu等[33]直接采用石墨烯氧化物對花生中黃曲霉毒素進行分離富集,與十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)等傳統固相萃取劑相比,吸附劑使用量更少,且重復使用10次,依然具有較好的吸附效果。Jiang等[34]設計并制備了一種還原氧化石墨烯/金納米復合物,通過引入金納米顆粒,可以增加石墨烯層間間距,降低團聚效應,能夠有效萃取牛奶中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等9種真菌毒素。Moreno等[35]將多壁碳納米管負載到C18修飾的磁性納米粒上得到磁性多壁碳納米管納米復合物,用于玉米中玉米赤霉烯酮及其次級代謝產物的萃取富集,其富集因子為25,重復使用6次,仍能保持較好的提取效率。Ma等[36]以磁性多壁碳納米管(Fe3O4-MWCNTs)作為吸附劑,能夠對谷物中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、展青霉素等20種真菌毒素分散固相萃取,利用Fe3O4固有磁性可實現前處理中固液兩相的快速分離,比C18、N-丙基乙二胺等傳統固相吸附劑具有更高的富集效率和更短的前處理時間。

1.2 聚合物材料

聚合物材料在食品真菌毒素樣品前處理中的應用較早,始于聚合物分離柱,近年來多集中于功能聚合物的開發及應用,其中分子印跡聚合物應用最為廣泛。分子印跡聚合物材料通過引入目標物模板分子進行聚合,再對模板分子進行洗脫,并在聚合物中留下模板分子空穴結構和大小的“印跡”,這種“印跡”結構能夠特異性識別目標分子及其結構類似物。因此,分子印跡聚合物具有較好的構效預定性和選擇性,且耐高溫,耐酸堿和有機溶劑,常用作固相萃取技術和固相微萃取技術的吸附劑[37,38]。Wei等[39]直接采用黃曲霉毒素AFB1為模板分子乳液聚合制備分子印跡聚合物,其AFB1吸附量接近非印跡聚合物的2倍,將其用于大麥、花生油、啤酒和飼料中AFB1的選擇性富集,經HPLC檢測,與商品化免疫親和柱具有同樣的回收效果。Szumski等[40]采用黃曲霉毒素結構類似物5,7-二甲氧基香豆素作為模板分子來代替黃曲霉毒素分子制備分子印跡聚合物,對水樣中黃曲霉毒素固相萃取分離,依然具有選擇性富集效果,并且結構類似物具有較低成本優勢。Huang等[41]制備了一種能夠選擇性識別玉米赤霉烯酮的金屬有機骨架-分子印跡復合物MIL-101@MIPs,對玉米赤霉烯酮的吸附量接近非印跡聚合物的2倍,可以實現谷物中玉米赤霉烯酮的萃取分離,循環使用7次,回收率仍能保持70%以上。相比傳統的分子印跡聚合物,表面分子印跡具有更明顯的目標分子空穴位,吸附速度也更快,Huang等[42]將分子印跡聚合物復合在埃洛石修飾的Fe3O4磁性納米粒表面,制得具有核-殼結構的磁性分子印跡復合物SPMIPs,用于小麥樣品中分散固相萃取玉米赤霉烯酮,印跡因子為2.97,同時利用磁性納米材料易分離特性,進一步縮短了前處理時間。此外,其他一些新型功能聚合物也有用于食品基質真菌毒素樣品前處理的報道,如具有高孔隙率的電紡纖維聚合物用于富集大豆中的黃曲霉毒素[43],多孔結構的籠型倍半硅氧烷聚合物輔助提取啤酒中的赭曲霉毒素A[44],這些介質的開發,進一步擴展了聚合物在食品真菌毒素樣品前處理中的應用范圍。

1.3 生物材料

生物類材料在食品真菌毒素樣品前處理中的應用目前主要以免疫親和材料和適配體功能化材料為主。免疫親和材料是利用抗體和抗原之間高度特異性的親和力以實現目標物的分離與純化,如免疫親和柱,具有特異性強、選擇性好、富集效率高等特點[45]。Zhao等[46]在采用免疫親和柱對食品用香料中赭曲霉毒素A選擇性分離凈化后,可直接采用HPLC技術檢測,回收率范圍為75%～102%。Vaclavikova等[47]將多毒素抗體免疫親和柱用于樣品前處理,能夠實現對花生、大麥、玉米食物中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素等12種真菌毒素的同時分離純化。Wilcox等[48]采用兩組串列多毒素免疫親和柱,提取麥片、乳清粉等多種食品基質中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和T-2毒素,同樣能實現多真菌毒素的同時富集。Zhang等[49]將玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素的單克隆抗體結合在聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)柱上制得多毒素抗體免疫親和柱,并應用于面粉實際樣品分析,結果表明該親和柱可以同時提取樣品中這4種真菌毒素,富集效率明顯高于純PS-DVB柱。

適配體功能化材料是利用適配體能夠高特異性識別和結合靶標分子從而進行分離純化的新型材料,具有特異性強、親和力高、靈敏度高、靶標分子范圍廣和易于修飾等特點,在食品真菌毒素樣品前處理中已有較多應用。如Girolamo等[50]將赭曲霉毒素A的DNA適配體與凝膠偶聯制得OTA適配體固相萃取柱,用于提取小麥中赭曲霉毒素A,結果表明該適配體固相萃取柱能特異性識別與親和小麥樣液中的赭曲霉毒素A,重復使用5次,依然具有較好的特異性識別能力。Brothier等[51]制備了一種基于DNA適配體識別的赭曲霉毒素A微型毛細管提取柱,能夠有效親和啤酒基質中的赭曲霉毒素A,含量可低至納克數量級。由于適配體較強的靶標特異性,通過適配體和其他功能材料結合,可以進一步提高分離純化效率[52]。如Wu等[53]將赭曲霉毒素A的DNA適配體修飾在磁性納米粒上得到適配體-磁性納米微球吸附劑,能夠對小麥粉等谷物制品中OTA選擇性富集,比C18柱具有更好的萃取效果。Khodadadi等[54]將黃曲霉毒素AFM1的DNA適配體修飾在Fe3O4磁性納米載體表面得到適配體-磁性納米復合物(AMNPs),可以選擇性富集乳制品中黃曲霉毒素AFM1,結合HPLC分析,檢出限可低至0.2 ng/L,但該適配體磁性納米復合物在目標物解吸過程中存在適配體流失,限制了其使用重復性?？傊?不同的介質材料,其結構特點各有差異,具有不同的分離富集效果。表2簡要總結了主要納米材料,聚合物材料和生物材料的結構特點以及它們的主要應用食品基質。

表 2 食品真菌毒素樣品前處理常用介質及其主要適用基質Table 2 Main preparation medium for mycotoxins in food samples and their applicable substrates

2 樣品前處理方法

食品樣品基質種類繁多,成分復雜,而樣品中真菌毒素含量通常低至μg/kg數量級,甚至ng/kg數量級,直接使用分析儀器定量檢測,往往無法得出準確結果。因此,在樣品的分析過程中,對樣品進行前處理十分必要。前處理過程可實現對目標物的提取、富集和純化,減少雜質干擾和提高檢測靈敏度。

2.1 液相萃取法

液相萃取技術利用相似相溶原理,將目標分子萃取到一種溶劑中,進而實現目標物和雜質的分離。常用的溶劑主要有甲醇、乙腈、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷等有機溶劑或者由幾種溶劑組合而成的復合溶劑。其中,液液萃取法是最為常用的傳統液相萃取方法,具有操作簡單、設備簡單、廣譜性好、價格低廉等優點,在真菌毒素樣品前處理中應用較早,技術也較成熟。Soleimany等[55]以乙腈-乙酸-水混合液為萃取劑,一步法直接提取谷物中的黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮,然后采用LC-MS定量分析,檢出限為0.01～20 ng/g,回收率為76.8%～108.4%, RSD小于12.7%。該方法能夠同時提取分析多種真菌毒素,并用于大米、玉米等谷物實際樣品分析。吳宇等[56]同樣也以乙腈-乙酸-水混合液為萃取劑,提取植物油中的黃曲霉毒素、伏馬菌毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等16種真菌毒素,然后采用低溫高速離心去除提取液中的油脂,結合UPLC-MS對其檢測,檢出限為0.1～66.7 μg/kg,回收率為74.2%～105.6%, RSD為0.3%～13.9%,并發現低溫高速離心法可以有效避免傳統凈化填料去除脂質過程中吸附真菌毒素而導致準確性下降的問題。

雖然液液萃取法操作簡單,但過程中有機溶劑消耗量較大,容易造成目標物流失,也不利于環境保護。Jeannot等[57]對液液萃取技術進行了改進,建立了液相微萃取技術。液相微萃取技術集萃取和濃縮過程于一體,具有溶劑消耗少、富集效率高、環境友好、節約成本等優點。Somsubsin等[58]以正辛醇-甲苯混合液作為萃取劑,Na2SO4為破乳劑,采用渦旋輔助液液微萃取技術,提取大米中黃曲霉毒素,結合HPLC分析檢測,檢出限為0.001 1～0.17 μg/kg,回收率為70%～104%, RSD低于6.2%,同時破乳劑的加入促進了相分離,無需進一步離心分離,縮短了前處理時間。近年來,分散液液微萃取(DLLME)是一種應用廣泛的液液微萃取技術,它采用噴射技術將萃取劑和分散劑快速注入樣品水液中,在分散劑作用下,形成水-分散劑-萃取劑乳濁液微珠,增大了萃取劑與樣液的接觸面積,進而提高萃取效率。Campone等[59]以氯仿為萃取劑,甲醇為分散劑,采用渦流混合分散形成氯仿-甲醇-水萃取乳濁液微珠,分散液液微萃取玉米、小麥、大米中的黃曲霉毒素,結合HPLC檢測,檢出限為0.01～0.17 μg/kg,回收率為67%～92%, RSD低于10%,與標準的免疫親和提取技術相比,具有富集倍數更高,前處理耗時更短和成本更低等優勢。Sun等[60]采用壓力噴射裝置將乙腈-水混合萃取劑注入樣液中直接形成分散性乳濁液萃取微珠,建立了一種小麥中黃曲霉毒素的DLLME-UPLC-MS分析檢測方法,回收率為83.2%～93.0%, RSD低于4.6%,定量限為0.06 μg/kg,低于歐盟限量標準。此外,壓力噴射直接形成分散萃取微珠,無需額外設備混合,進一步簡化了前處理步驟。Wang等[61]以二氯甲烷為萃取劑,三氟乙酸為衍生化試劑,分散液液微萃取植物油中黃曲霉毒素并對其衍生化,結合HPLC分析,檢出限為0.005～0.03 ng/mL,回收率為90.7%～121.5%, RSD低于11.6%,該方法集萃取與衍生于一體,節省了前處理時間。離子液體作為一種新型綠色溶劑,具有良好的化學穩定性、熱穩定性以及高溶解性等特點,可代替傳統有機溶劑作為萃取劑。Wang等[62]以1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體為萃取劑,渦旋輔助分散液液微萃取玉米食品中玉米赤霉烯酮,采用HPLC檢測,檢出限為0.3 μg/kg,回收率為83.5%～94.9%, RSD低于5%。Lai等[63]以1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體為萃取劑,采用分散液液微萃取技術提取米酒中赭曲霉毒素A,富集因子接近30,結合HPLC檢測,檢出限為0.04 μg/L, RSD低于10.4%。這些應用均表明離子液體在樣品前處理中具有替代部分有機萃取劑的潛力,應進一步加強研究與應用。

2.2 固相萃取法

固相萃取技術以色譜分離原理為基礎,采用合適的固體吸附材料吸附樣品中的目標分子,使其與其他干擾分離,然后再使目標分子從固體吸附劑中分離出來。固相萃取技術可以針對目標分子的結構和性質以及基質特點來選擇合適的固體吸附劑,因而具有富集效率高、選擇性較好、溶劑用量少等優點,是食品真菌毒素分析常用的樣品前處理方法。Liu等[64]設計并合成了一種超支化聚合物材料用于萃取谷物中的黃曲霉毒素,結合HPLC檢測,檢出限為0.012～0.12 ng/g,回收率為82.7%～103%, RSD低于10%,聚合物中大量的氫鍵供體基團和豐富的π電子基團結構能有效鍵和黃曲霉毒素分子,比傳統C18吸附劑具有更高的富集效率。利用石墨烯、碳納米管等碳材料較大比表面積和良好吸附性能,可以有效富集真菌毒素,Jiang等[34]采用還原氧化石墨烯-金納米復合物作為固相萃取吸附劑,建立了一種牛奶中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮等9種真菌毒素的SPE-UPLC-MS分析檢測方法,定量限可低至0.02 ng/mL,回收率為70.2%～111.2%, RSD低于14.9%,該方法能同時萃取分析多種真菌毒素,并已用于60種牛奶實際樣品的分析?；诜肿佑≯E技術制備的聚合物,可以進一步提高固相萃取的選擇性[65],如Rui等[66]將黃曲霉毒素分子印跡聚合物負載在介孔二氧化硅FDU-12上,得到一種介孔二氧化硅-分子印跡復合物FDU-12@MIPs,用于大米、玉米、小麥、花生和大豆中黃曲霉毒素的萃取分離,結合HPLC檢測,檢出限為0.05 μg/kg, RSD為2.73%～4.21%,該復合物AFs最大吸附量是非印跡聚合物的2倍多,表現出較好的選擇性富集。此外,固相萃取技術還可以和液相色譜等檢測儀器在線聯用,如Campone等[67]以C18材料作為預柱中的固相萃取吸附劑,并和超高效液相色譜及質譜聯用,建立了一種奶制品中黃曲霉毒素AFM1的在線SPE-UPLC/MS分析方法,回收率為86%～102%, RSD低于3%,定量限可低至0.5 ng/kg,遠低于歐盟限量標準。Campone等[68]又建立了酒類中赭曲霉毒素A的在線SPE-HPLC-MS/MS分析方法,檢出限為0.01 ng/mL, RSD低于7%,固相萃取-色譜檢測在線聯用技術可以減少前處理過程中目標物的流失,具有更高的檢測靈敏度。

固相微萃取技術是在固相萃取技術基礎上發展而來的一種新型非溶劑型固相萃取方法。Lee等[69]將聚丙烯孔膜封裝在內含赭曲霉毒素A分子印跡聚合物的微萃取柱中,選擇性固相微萃取咖啡和葡萄汁中的赭曲霉毒素A,甲醇-乙酸混合液超聲解吸后,采用HPLC檢測,檢出限分別為0.06 ng/g和0.02 ng/mL,回收率為90.6%～101.5%, RSD低于2.3%,并可循環使用15次。Andrade等[70]將十八烷基硅烷顆粒內置在毛細管內作為預處理柱,建立了一種酒樣中赭曲霉毒素A的在線SPME-UPLC/MS分析方法,定量限為0.02 μg/L, RSD低于6%,分析速度較快,整個分析時間僅為24 min。固相微萃取技術兼具了固相萃取技術操作簡單、溶劑消耗少等優點,并進一步提高了富集效率,且體積較小,易于和液相色譜、質譜等儀器自動化聯用,具有廣闊的應用潛力。

2.3 場輔助提取法

場輔助提取法通過在聲、磁、微波等外場的作用下,加快目標分子在樣品基質和提取劑之間的傳質速率,促使目標分子更快、更有效地從樣品基質轉移至提取劑中,進而提高提取速度,縮短前處理時間,常用的場輔助提取技術主要包括磁性固相萃取、超聲輔助提取和微波輔助提取等。

磁性固相萃取是以磁性或磁化的材料作為吸附介質吸附目標分子,再在外加磁場的作用下,使目標分子與其他基質發生強化分離。相比于傳統的固相萃取材料,磁性材料具有更大的表面積,更容易分離,重復使用性好和易功能化修飾等優勢。Taherimaslak等[71]將3-(三甲氧基硅基)-1-丙硫醇和乙二醇雙巰基乙酸酯修飾在磁性Fe3O4納米粒上,以增大表面積,其富集因子可達57,用于萃取牛奶中黃曲霉毒素AFM1,吸附及解吸時間不到15 min,比傳統的固相萃取技術耗時更短。Hu等[72]以磁性氧化物Fe3O4/NPs為核,結合分子印跡技術,制備了一種專一性的分子印跡磁性納米復合材料OTA-Fe3O4@PDA-MIPs,能選擇性萃取大米和葡萄酒中的赭曲霉毒素A,結合HPLC檢測,檢出限可分別低至0.001 8 μg/kg和1.8 pg/mL,回收率為71.0%～88.5%, RSD低于3.8%,并可循環使用7次。將抗體等生物識別分子修飾在磁性納米粒上可以進一步提高選擇性和富集效率,如Yu等[73]將黃曲霉毒素AFB1抗體修飾在Fe3O4納米粒表面制得一種免疫磁性納米粒,固相萃取植物油中的黃曲霉毒素AFB1,同時結合低溫脫脂技術,有效去除植物油基體油脂雜質,熒光光譜檢測,檢出限低至4.8 pg/mL,回收率范圍為79.6%～117.9%, RSD低于11.48%。Ye等[74]采用自制的免疫親和磁性納米微球IMB作為吸附劑,能夠特異性親和赭曲霉毒素A,建立了一種谷物中赭曲霉毒素A的UPLC分析方法,檢出限為0.24 μg/kg,回收率為86.3%～95.4%, RSD低于7.9%,結果與標準的免疫親和柱法具有較好的一致性,且分析速度更快。

超聲輔助提取是利用超聲波產生的強烈振蕩和空化效應來促使目標分子不斷向溶劑中遷移,進而達到目標物和雜質分離的效果。實際應用中,超聲輔助提取通常與液液萃取、液液微萃取、固相萃取、固相微萃取、QuEChERS等方法聯合使用。因此,相比原來單一的提取方法,超聲輔助提取具有提取時間短、富集效率高和溶劑消耗少等優勢。Ruan等[75]采用超聲輔助-分散液液微萃取技術分離提取水果中赭曲霉毒素A和桔霉素,結合HPLC定量檢測,檢出限為0.06～0.16 μg/kg,回收率為75%～103%, RSD低于5.3%。與液液萃取、固相微萃取技術相比,該方法溶劑消耗更少,所需樣品量更少,提取時間也更短。Porto-Figueira等[76]采用超聲輔助-QuEChERS提取技術對谷物中玉米赤霉烯酮萃取富集,比單獨QuEChERS技術，超聲輔助提取所需溶劑和層析鹽均更少。Amirkhizi等[77]同樣采用超聲輔助-分散液液微萃取技術,建立了一種雞蛋中黃曲霉毒素AFB1的HPLC分析方法,檢出限為0.12 μg/kg,回收率為91%～94%, RSD低于8.3%。與標準的免疫親和柱提取法相比,該方法富集效率更高,提取速度更快,成本更低。

微波輔助提取是一種通過微波能對提取溶劑進行加熱,促使目標分子從樣品基質中遷移出來并進入溶劑中的萃取方法,具有加熱均勻、提取速度快等特點。Chen等[78]以乙腈為提取溶劑,采用微波輔助-固相萃取技術提取玉米和大麥中的黃曲霉毒素,采用LC檢測,檢出限為0.04～0.08 μg/kg,回收率為88.1%～105.7%, RSD低于8.7%,并用于當地市場上36種玉米和小麥的分析。Du等[79]采用微波輔助-固相微萃取技術,富集桃仁、奶粉、玉米粉和啤酒中的黃曲霉毒素AFB1、伏馬菌毒素、赭曲霉毒素B、T-2毒素和玉米赤霉烯酮6種真菌毒素,三氯甲烷解吸后,采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜(UHPLC-Q-TOF/MS)檢測,固體樣品中真菌毒素檢出限為0.003 6～0.033 μg/kg,啤酒中真菌毒素檢出限為0.002 2～0.017 ng/mL,回收率為84.27%～104.96%, RSD低于2.76%。與SPE-UPLC-MS、DLLME-HPLC分析方法相比,該方法萃取時間更短,溶劑消耗更少,檢出限更低。

2.4 其他樣品前處理方法

除上述樣品前處理技術以外,還有部分新發展的技術,如QuEChERS法、免疫親和柱法和基質固相分散技術等。QuEChERS法最早由Anastassiades在2003年提出,通過利用吸附劑填料與樣品基質中的雜質相互作用來吸附雜質,進而達到除雜凈化的目的。QuEChERS技術主要包括乙腈提取、鹽析分層、吸附除雜3個過程,是一種集快速、簡單、便宜、有效、可靠、安全于一體的樣品前處理技術[80]。Pereira等[81]以乙腈水溶液為提取劑,硫酸鎂和氯化鈉為鹽析劑,N-丙基乙二胺為固相吸附劑,采用QuEChERS技術,提取麥粉等嬰兒食品中12種單端孢霉烯族毒素,比免疫親和柱提取速度更快,成本更低。Rodriguez-Carrasco等[82]采用乙腈水溶液對樣液進行提取,硫酸鎂和氯化鈉鹽析后,再用C18吸附凈化,采用氣相色譜-三重四極桿質譜(GC-QqQ-MS)檢測,建立了一種小麥粉中玉米赤霉烯酮、展青霉毒素、單端孢霉烯族毒素等10種真菌毒素的QuEChERS-GC-QqQ-MS分析方法,回收率為74%～124%, RSD低于17%,定量限為1.25 μg/kg,低于歐盟規定的最大殘留量,并用于15種實際樣品的分析檢測。此外,由于QuEChERS技術較強的通用性,還可以應用于咖啡、酒、植物油等多種食品基質中真菌毒素的提取[83-86]。將QuEChERS技術與其他前處理技術結合使用,能進一步提高富集效率和檢測靈敏度,如Arroyo-Manzanares等[87]先采用QuEChERS技術對樣品液預處理,再用分散液液微萃取技術進一步富集,建立了一種牛奶薊中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等14種真菌毒素的UPLC-MS分析方法,檢出限為0.56 μg/kg, RSD低于10%。兩種前處理技術的結合使用,實現了食品中更多種類的真菌毒素提取與分析。Gonzalez-Jartin等[88]將QuEChERS技術和分散固相提取技術結合使用,建立了一種啤酒中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等23種真菌毒素的UPLC-MS分析方法,回收率為70%～110%, RSD低于5.5%,定量限為0.038 μg/L,具有較好的靈敏度和精密度?？傊?QuEChERS技術不受樣品基質狀態的限制,能夠對多種目標物同時提取分析,還可以和液相萃取、固相萃取、固相微萃取等技術聯合使用,純化速度快,兼容對象多,靈活性強,在食品真菌毒素樣品前處理領域應用越來越廣。

免疫親和柱法是一種以抗體與抗原特異性結合為基礎的新型固相萃取技術,其過程一般包括溶解、捕獲、洗脫與純化3個步驟,具有特異性強、選擇性好、富集效率高等特點,且部分真菌毒素的免疫親和柱已實現商品化。如Ossa等[89]先對雪糕樣液低溫離心脫脂后,采用商品化的免疫親和柱選擇性富集雪糕中的黃曲霉毒素AFM1,再用甲醇-乙腈混合液洗脫,結合UPLC-MS檢測,檢出限可低至0.4 ng/kg。Shuib等[90]對牛奶樣液離心脫脂后,采用AFLATEST免疫親和柱選擇性提取、甲醇洗脫的前處理方法,建立了一種乳制品中黃曲霉毒素AFM1的柱后光化學衍生-HPLC分析方法,回收率為85.2%～107.0%, RSD低于7%,定量限為0.004 μg/L,遠低于0.025 μg/L的歐盟限量標準,同時在線紫外光衍生技術的使用,進一步提高了檢測靈敏度,并已用于牛奶、羊乳、嬰兒奶粉等20種實際樣品的分析。將多種真菌毒素抗體修飾在免疫親和柱上可實現黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌毒素等多種真菌毒素的同時富集[46,91],如Zhang等[92]將黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、T-2毒素的單克隆抗體結合在瓊脂凝膠上制得多毒素抗體復合免疫親和柱mIAC,用于富集花生、玉米、小麥農產品中的真菌毒素,整個過程僅用2 min,提取速度快,結合HPLC-MS檢測,檢出限為0.04～0.4 μg/kg,回收率為98.8%～102.3%, RSD低于3.95%,靈敏度較高,重現性也較好。Hu等[93]采用自制的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、雜色曲霉素等8種真菌毒素的單克隆抗體復合免疫親和柱,建立了一種飼料中8種真菌毒素的UPLC-MS分析方法,檢出限為0.006～0.12 ng/mL,回收率為91.2%～104.1%, RSD低于10%,比商品化免疫親和柱富集真菌毒素種類更多,靈敏度更高,該方法已用于當地市場80種實際飼料樣品的分析。盡管IAC相比SPE具有更好的選擇性,更高的富集效率,但存在穩定性較差、價格昂貴、重復利用率低等問題,這些也制約著免疫親和柱法在實際中更為廣泛的應用。

基質固相分散提取技術通過將固態或黏稠態樣品與固相分散劑一起研磨粉碎,使樣品基質分散在固體分散劑的表面,然后將混合物轉移到固相萃取柱中,最后選擇合適的溶劑將目標物洗脫下來。Oliveira等[94]以硅膠作為固相分散劑,甲酸銨緩沖液為洗脫劑,采用基質固相分散萃取技術,提取玉米、玉米爆米花及玉米燕麥粉中伏馬菌毒素B1和B2,整個過程操作簡單,溶劑消耗也較少。Rubert等[95]以十八烷基硅烷作為固相分散劑,甲醇-乙腈混合液為洗脫劑,建立了一種谷物中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、白僵菌毒素等真菌毒素的MSPD-LC-MS分析方法,回收率為68.7%～89.6%, RSD低于14%,檢出限可低至0.1 ng/g,遠低于歐盟限量標準,并用于大米、小麥、玉米等49種實際樣品的分析。Wu等[96]以硅膠和硅藻土作為固體分散劑,四丁基氯化銨-乙醇混合液為低共熔溶劑,開發了一種低共熔溶劑介入-基質固相分散提取(DES-MSPD)技術,用于提取花生、小米、火麻仁中的黃曲霉毒素,結合HPLC檢測,檢出限為0.03～0.1 μg/kg,回收率為90%～105%, RSD低于7.5%,低共溶劑的介入進一步拓展了其分散性,比C18和N-丙基乙二胺固相分散劑具有更好的富集效果?；|固相分散提取技術將提取和純化濃縮于一體,無需樣品溶解和勻化,可以減少溶劑消耗和簡化前處理過程,特別適合固態和黏稠態樣品待測物提取凈化。

3 結論與展望

真菌毒素作為一種高毒性物質,因其存在范圍廣、污染頻率高,可以通過多種渠道多種方式進入各類食品當中,對人類健康安全構成嚴重隱患而受到廣泛關注。由于食品基質種類繁多、基質構成組分復雜、真菌毒素含量低、多種真菌毒素同時共存等諸多問題,食品樣品中真菌毒素的直接分析檢測面臨挑戰。雖然已開發多種分離富集技術應用于復雜食品樣品的前處理,但依然面臨很多限制,如液相萃取技術的溶劑消耗量大,富集效率較低,固相萃取技術耗時較長,吸附劑制備繁瑣,而免疫親和技術成本較高,通量較低。因此,開發高選擇性、高通量、高效環保、低成本的前處理技術依然是食品真菌毒素分析的重要研究內容,同時發展結合高效樣品前處理-靈敏檢測技術于一體的聯用技術也是未來的重要研究方向。