PINK1、Parkin與泛素協同調控線粒體自噬的研究進展

張明軍，羅俊一，楊毅寧

(新疆醫科大學第一附屬醫院心臟中心冠心病一科，烏魯木齊 830000)

自噬是真核細胞生物的生理功能，可以降解細胞內容物，維持細胞內環境的穩態。通過自噬，細胞內的氨基酸和脂肪酸等物質被回收利用，產生的腺嘌呤核苷三磷酸能夠參與細胞的信號轉導、能量代謝等多種細胞活動。自噬目前被分為巨自噬、微自噬以及分子伴侶介導的自噬，巨自噬的特征在于形成自噬體，雙膜結構的自噬體能夠吞噬細胞器并與溶酶體融合；微自噬是通過膜表面的內陷將胞質內容物直接吞入溶酶體中；分子伴侶介導的自噬以熱激蛋白70介導的方式將蛋白質直接轉運到溶酶體中[1-3]。自噬也可以分為選擇性自噬和非選擇性自噬，通過選擇性自噬，細胞能夠對線粒體、內質網、溶酶體等細胞器進行選擇性降解[1,4-5]。Lemasters[6]在2005年首次引入“線粒體自噬”來描述線粒體的選擇性自噬。線粒體自噬屬于巨自噬的一種，通過自噬能夠維持線粒體的穩態，保證供能細胞器的正常功能，對于細胞的新陳代謝及細胞凋亡等過程具有重要作用。線粒體自噬主要分為兩種：一種是PTEN誘導的假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)-Parkin依賴性線粒體自噬；另一種是PINK1-Parkin非依賴性線粒體自噬，包括FUNDC1(FUN14 domain containing 1)參與的線粒體自噬和Bnip3L/Nix(Bcl2 interacting protein 3 like/NIP3-like protein X)介導的線粒體自噬。近些年的研究表明，PINK1、Parkin以及泛素協同調控線粒體自噬對于線粒體的質量控制及正常功能的維持起到重要作用[7-9]?，F就PINK1、Parkin與泛素協同調控線粒體自噬的研究進展予以綜述。

1 PINK1、Parkin及泛素的結構和功能

PINK1、Parkin及泛素是線粒體自噬中的關鍵作用因子，在線粒體自噬的啟動及發生過程中均起到重要的作用。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，由581個氨基酸組成，分為N端的線粒體定位序列、跨膜序列、絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域以及C端結構域[10]。在正常線粒體中，線粒體的跨膜電位通過線粒體外膜轉運酶和內膜轉運酶將PINK1轉運至線粒體內膜，在線粒體內膜中，線粒體加工肽酶去除PINK1的N端線粒體靶向信號后，早老素相關菱形蛋白在PINK1疏水結構域中的氨基酸A103和F104之間切割PINK1，產生分子量為52 000含有激酶結構域的蛋白質片段，并將其釋放到細胞質中，而泛素連接酶靶向PINK1被切割后的該蛋白質片段使其泛素化，并通過蛋白酶降解[11-12]。在受損的線粒體中，跨膜電位被破壞，線粒體外膜轉運酶和內膜轉運酶無法正常作用，造成PINK1的轉位和降解被阻斷，使PINK1聚集在線粒體外膜表面，從而通過介導Parkin的激活及泛素磷酸化啟動線粒體自噬[13-15]。因此，PINK1在線粒體外膜的聚集也可以反映線粒體的損傷。

Parkin是一種E3泛素連接酶，它含有N端泛素樣結構域(ubiquitin-like，UBL)、特異性Parkin結構域(unique parkin domain，UPD)、結合E2酶的結構域RING1、RING中間結構域(in-between RING，IBR)、抑制性成分(repressive，REP)以及C端含催化性Cys431結構域的RING2[16]。在正常狀態下，Parkin通過以下幾種機制以自動抑制的形式存在于細胞質中，防止自身轉化為活性酶。Parkin的UBL拮抗RING1內的核心α-螺旋元件，阻斷E2泛素偶聯酶的進入；REP同時與UBL結構域和RING1對接，進一步阻斷RING1與E2泛素偶聯酶的結合位點；RING2中的Cys431殘基被UBL結構域和RING1之間的UPD掩蓋，從而阻斷泛素與Cys431的結合[17-18]。當線粒體損傷后，Parkin的構象發生變化，并由抑制狀態轉化為有活性的E3泛素連接酶，Parkin激活后，在線粒體自噬過程中起到促進PINK1介導的泛素磷酸化、放大泛素磷酸化信號等重要作用[16,19-21]。

泛素是一種含76個氨基酸的蛋白質，位于細胞質中，可與其他蛋白質中的賴氨酸殘基共價結合，從而產生不同反應；泛素一般通過泛素系統進行加載和轉移組成泛素鏈而在線粒體自噬中起作用，泛素鏈的形態多樣，有線型、分支型或是混合型，不同泛素鏈產生的反應不同，可以通過特定的泛素結合域來區分[18]。泛素鏈通過泛素結合域與PINK1及Parkin相互作用，可以促進線粒體外膜底物的提取，參與信號的轉導及自噬受體的募集，從而在線粒體自噬中起到正向作用[16,22-26]。

2 PINK1在線粒體自噬中的作用

PINK1目前被認為是線粒體損傷的主要探測器，當線粒體受損時，線粒體膜失去保持跨膜電位的能力，PINK1在線粒體外膜上聚集并與線粒體外膜轉運酶結合，而線粒體外膜轉運酶中的亞基Tom7進一步促進PINK1在粒體外膜的橫向釋放及聚集[27]，并避免了PINK1的降解[28]。聚集的PINK1結合泛素鏈或Parkin啟動線粒體自噬[29]，因此通過對PINK1的檢測也能反映出線粒體自噬的發生。PINK1主要通過兩種方式參與線粒體自噬。一方面，PINK1介導Parkin的磷酸化，Parkin的UBL氨基酸序列約30%與泛素相同(約50%與泛素相似)[30]；另外，UBL中的Ser65與泛素中的Ser65一致，這一特點使PINK1可以同時磷酸化UBL中的Ser65，并產生Ser65磷酸化的Parkin(phosphorylation of Parkin at Ser65，pSer65-Parkin)[29,31-32]。另一方面，PINK1介導泛素的磷酸化，通過納米抗體發現，PINK1的N端包含有不存在于其他蛋白激酶中的氨基酸序列(稱為插入序列)，PINK1中的Ser202和Ser204自動磷酸化后形成插入構象，從而識別泛素；當泛素與PINK1結合后，會產生一種獨特的C端回縮構象，這種構象中泛素的Ser65殘基能夠更加靠近PINK1的催化中心并被其磷酸化，產生Ser65磷酸化的泛素(phosphorylation of ubiquitin at Ser65，pSer65-Ub)[33]。pSer65-Parkin結合pSer65-Ub能夠增強泛素鏈的組裝活性，使其能夠更加迅速地包圍受損線粒體，引起線粒體的泛素化；此外，PINK1能夠募集自噬受體至線粒體膜表面參與自噬體的形成[34-35]。

3 Parkin在線粒體自噬中的作用

Parkin在正常狀態下處于抑制形式，在線粒體受損后Parkin的E3泛素連接酶活性被激活。目前認為線粒體可以通過兩種機制激活Parkin：PINK1直接激活Parkin，當線粒體損傷后，PINK1聚集在線粒體外膜，能夠直接介導Parkin UBL中的Ser65磷酸化，UBL構象改變，并引起REP構象的微小變化，多次的構象變化使Parkin被激活；泛素磷酸化介導的Parkin激活，PINK1介導泛素磷酸化并在泛素表面產生Parkin的結合位點[22,32]，與此同時，Parkin中的K151(UPD內)和H302、R305以及Y312(IBR與RING1結構域內)組成泛素結合口袋，當泛素和Parkin結合后使Parkin的構象發生改變，從而使Parkin被激活[22,25-26]。在Parkin的激活過程中，泛素能夠與RING2的Cys413結合并形成硫酯鍵，而這種形成硫酯鍵的能力被認為是監測Parkin活性狀態的指標[16]。當Parkin被激活后，能夠將經過E1泛素激活酶及E2泛素偶聯酶活化的泛素轉移至線粒體外膜蛋白的賴氨酸殘基上，使其與PINK1相互作用[18]。目前認為，除了泛素，Parkin的底物還包括多種線粒體蛋白，如電壓依賴性陰離子通道、線粒體融合蛋白(mitofusin gene，Mfn)1/2、線粒體外膜轉運蛋白、線粒體動力相關蛋白、Miro 1/2和線粒體己糖激酶等[36-38]。

4 泛素在線粒體自噬中的作用

泛素在線粒體自噬中主要通過泛素鏈的形式產生作用，泛素鏈能夠結合線粒體膜表面蛋白，從而產生不同的生理作用。線粒體的泛素化是指在線粒體受損后，PINK1介導泛素和Parkin的磷酸化，并形成正反饋，引起泛素鏈在線粒體外膜表面的快速聚合，同時結合膜表面的蛋白，從而使受損線粒體被泛素鏈包繞的過程[16]。相對于Parkin，泛素鏈與底物結合的特異性更高，能夠結合特定的自噬受體，從而介導線粒體自噬，但目前對于泛素鏈和線粒體膜表面底物特異性結合的研究較少。線粒體泛素鏈連接類型的定量分析表明，PINK1-Parkin線粒體自噬過程中主要形成Lys48和Lys63連接型的泛素鏈，此外，還發現了大量非典型的泛素鏈，包括Lys6和Lys11連接型的泛素鏈；Parkin與Lys48連接型的泛素鏈相互作用，可以促進線粒體外膜的底物提取和蛋白酶體降解，從而在線粒體自噬中發揮正向作用，而Lys63連接型的泛素鏈通過募集自噬受體在PINK1-Parkin依賴性線粒體自噬中起作用[18]。用精氨酸替代泛素鏈中的Lys6或Lys63會降低線粒體自噬水平[35,39]，表明在線粒體自噬中Lys63類型的泛素鏈起到更重要的作用。同時，磷酸化的泛素可以募集unc-51樣自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)、DFCP1(double FYVE domain-containing protein)、WD重復域磷酸肌醇結合蛋白1(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 1，WIPI1)和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)至線粒體膜上，促進線粒體自噬[9]。

5 PINK1、Parkin協同泛素調控線粒體自噬的發生

線粒體損傷后引起線粒體外膜上PINK1堆積，介導Parkin及泛素的磷酸化，通過正反饋過程，使線粒體泛素化，并募集自噬受體至線粒體外膜進一步形成自噬體，自噬體與溶酶體融合導致自噬體內容物的降解[9,11,14,16]。在線粒體自噬過程中，PINK1、Parkin及泛素既能獨立作用，又可以相互作用影響線粒體自噬的發生、發展。

有研究認為，泛素的Ser65被PINK1磷酸化不僅是線粒體自噬的關鍵因素，也是Parkin被激活的一種重要機制[16]。除此之外，PINK1還能磷酸化Mfn2，并使Mfn2作為心肌細胞內Parkin的線粒體膜受體[40]。Mfn1和Mfn2在PINK1及Parkin激活后迅速降解，從而防止受損線粒體與正常線粒體融合，在缺乏Mfn1和Mfn2小鼠的胚胎成纖維細胞中，仍然可以觀察到Parkin向線粒體轉位，表明存在一種替代或補償機制用于募集Parkin[41]。而線粒體外膜上PINK1的穩定表達可以募集Parkin并誘導線粒體自噬的發生[13]。這些結果都說明PINK1在Parkin的上游起作用。當PINK1在線粒體膜表面缺失時，只有1%的野生型細胞還存在線粒體自噬活動，而使用雷帕霉素誘導PINK1至線粒體后，線粒體自噬的水平增加了約7倍[16]。除了協同Parkin介導的線粒體自噬外，PINK1還具有其他功能，包括介導腫瘤壞死因子受體相關蛋白1的磷酸化以防止細胞凋亡[42]。

Parkin通過泛素化以及對Mfn1和Mfn2的降解促進線粒體分裂，進而導致線粒體自噬增加，還通過標記線粒體轉運蛋白Miro使Miro降解來進一步促進受損線粒體的分離[43]。Parkin的表達增加會顯著增加細胞中線粒體自噬的水平，在Parkin剔除的細胞中，PINK1能通過磷酸化泛素恢復線粒體自噬的發生，但雷帕霉素無法增強Parkin剔除細胞線粒體的自噬作用[17,32,44]；Parkin剔除的小鼠雖然會有Parkin非依賴性線粒體自噬的補償作用，但其心肌細胞的線粒體失去正常的組織形態，同時伴有或不伴有線粒體功能障礙[45-46]；Parkin的剔除在果蠅的心臟中也會造成線粒體自噬的缺陷，從而引起顯著的收縮功能障礙[47]。此外，研究表明，p53通過隔離細胞質中的Parkin抑制線粒體自噬，而在線粒體外膜上Bcl-2家族蛋白通過抑制Parkin轉位至線粒體膜表面來抑制線粒體自噬[48]。這些也都表明了Parkin在線粒體自噬中的重要作用。

泛素鏈的組成對于線粒體自噬是必需的，通過調控泛素鏈的合成，可以調控線粒體自噬的水平。在泛素化過程中，pSer65-Ub與pSer65-Parkin結合能夠達到泛素鏈組裝的最大活性，約是與Parkin結合的20倍，比泛素與Parkin結合的泛素鏈合成活性高出約4 400倍[13,29,31]。Parkin-pSer65-Ub復合物形成的關鍵是Parkin中的殘基簇(Lys151和His302)與pSer65-Ub中磷酸的結合，使Parkin與泛素能夠相互作用[23,25-26]。這種復合物的形成使Parkin的泛素連接酶活性增加了約1 000倍，從而促成線粒體外膜上的泛素鏈組裝，并且極大地增加了PINK1磷酸化Parkin的UBL結構域的速度[9]。泛素特異性蛋白酶30(ubiquitin-specific protease 30，USP30)是一種去泛素化酶，能夠去除線粒體外膜Parkin結合的泛素鏈，減少線粒體外膜對Parkin的募集，從而抑制線粒體自噬的發生[49-50]。而Parkin靶向USP30并促進其蛋白酶體的降解，可能是為了消除USP30在Parkin依賴性線粒體泛素化過程中的負向作用[51]。但USP30在Parkin或PINK1功能降低的細胞中能夠增強線粒體自噬的水平，其具體機制尚不清楚[52]。

線粒體泛素化后，PINK1、Parkin協同泛素鏈募集自噬受體至線粒體外膜上，從而促進自噬體形成并包圍受損線粒體，自噬體與溶酶體融合并將受損線粒體降解為氨基酸等小物質分子回收利用[9,11,16,48]。目前發現主要有5個自噬受體在PINK1-Parkin依賴性線粒體自噬中起作用，包括NBR1(neighbor of BRCA1 gene 1)、OPTN(optineurin)、NDP52(nuclear protein database 52)、TAX1BP1(Tax1-binding protein 1)以及SQSTM1(sequestosome 1)/p62[26]。自噬受體被募集至線粒體后，通過UBD與泛素結合，同時通過LC3相互作用區域與LC3/γ-氨基丁酸及其A型受體相關蛋白結合，以促進受損線粒體被自噬體吞噬[53]。在NBR1、OPTN、NDP52、TAX1BP1以及SQSTM1/p62這5種自噬性受體中，OPTN和NDP52是主要的受體，可以有效地結合到Lys63泛素鏈上[26-27]。有研究表明，OPTN優先與pSer65-Ub結合，在Parkin剔除的細胞中，NBR1、TAX1BP1以及SQSTM1/p62均無法被募集至線粒體膜表面，而通過PINK1的磷酸化及泛素鏈的泛素結合域可以募集OPTN和NDP52以進行線粒體自噬，但PINK1剔除后，自噬受體的募集明顯受到抑制[9]。這些均表明，PINK1、Parkin及泛素在自噬受體的募集過程中也扮演著重要的角色。

6 小 結

PINK1除了起到線粒體損傷傳感器的作用外，還能介導Parkin及泛素的磷酸化，此外，在自噬受體的募集中PINK1也不可缺少。Parkin除了放大PINK1磷酸化泛素的信號，同樣也可以募集泛素至線粒體表面。泛素能夠組成多種泛素鏈，包繞受損線粒體使其泛素化，并結合自噬受體至線粒體表面形成自噬體。除Parkin外，PINK1能否激活其他泛素連接酶目前尚不可知，而泛素鏈類型和自噬性受體識別間存在的特異性也未知。另外，其他線粒體質量控制途徑與PINK1及Parkin的相互作用方式也不明確。因此，雖然線粒體自噬對于線粒體的氧化磷酸化功能至關重要，但仍需進一步研究。