乳腺導管原位癌浸潤機制的研究進展

張雪，薛美玲，段秀慶

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院乳腺外科，哈爾濱 150001)

導管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)又稱為導管內癌，病變從末梢導管小葉開始，經過細胞異常生長的不同階段，最終發展為DCIS。構成DCIS的細胞具有惡性細胞的特征，但被局限在正常的導管結構內，并未侵襲肌上皮細胞層和基膜。隨著浸潤性成分的出現，DCIS演變為浸潤性導管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)，因此DCIS被認為是IDC的癌前病變[1]。近年的研究也檢測到同一患者的DCIS成分與浸潤性成分的分子相似性[2]。其中，最能證明DCIS 到 IDC是一個連續發展過程的證據是其影響著同一解剖部位。在對 DCIS 的縱向研究中，活組織檢查發現，20%～25%的DCIS在同一乳房的同一象限內演變成了IDC[3]。雖然DCIS可治愈，但因其是潛在致命的侵襲性乳腺癌的非專一性前體[4]，故其危害性不可忽視。自20世紀80年代乳房X線照射技術問世以來，DCIS的診斷率逐步提高。在美國新診斷的乳腺癌中，DCIS約占20%[5]。DCIS向IDC發展的機制尚待闡明。到目前為止，仍不能準確區分哪些乳腺癌會保持持續惰性而進展為IDC。因此，不管是否需要進行輔助放化療或內分泌治療，所有被診斷為DCIS的患者均被不加選擇地進行手術切除治療[5]。這對于找出高侵襲性進展DCIS的發生機制，并行針對性治療提出了挑戰?，F就腫瘤微環境中細胞及細胞外基質、表觀遺傳學及基因變異在DCIS浸潤過程中發揮的作用予以綜述。

1 腫瘤微環境中細胞和細胞外基質的作用

腫瘤微環境是指腫瘤發生、生長、轉移以及腫瘤細胞所處的內外環境，包括腫瘤所在組織的結構、功能和代謝，并與腫瘤細胞自身(核和胞質)的內在環境有關。研究表明，構成微環境的細胞(肌上皮細胞、成纖維細胞、白細胞)、細胞外基質(extracellular matrix，ECM)以及分子可以調節乳腺癌的組織特異性以及乳腺癌細胞的生長、存活、極性以及侵襲行為[6]。因此，腫瘤微環境對于正常乳腺的發育和乳腺腫瘤的發生非常重要[7]。

1.1肌上皮細胞 在正常乳腺中，肌上皮細胞與基膜接觸，包圍腔上皮細胞，后者依次排列在導管和腺泡中。肌上皮細胞被認為是正常乳腺發育和功能作用的調節劑，在泌乳過程中通過其收縮功能使乳汁從導管內排出，且對腔上皮細胞的極性、增殖和分化也有重要作用。肌上皮細胞通過分泌蛋白酶抑制劑以及下調基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的水平影響腫瘤細胞的生長、侵襲和血管生成。組織學上，肌上皮細胞的丟失是區分DCIS和IDC的一個關鍵因素，人們對肌上皮細胞丟失的機制以及是否調節腫瘤細胞的侵襲進行了廣泛研究?？蛊交】贵w、肌球蛋白重鏈、s100、p63、CD10以細胞角蛋白14/17等標志物可識別肌上皮細胞。DCIS異種移植模型的發展為研究DCIS的進展機制奠定了基礎[8]。理想的模型是將人乳腺癌細胞注入乳腺導管系統后引發導管內病變形成，并侵入周圍組織[8]。Russell等[9]發現，肌上皮細胞在入侵前會丟失其自身的某些標志物，如p63、鈣結合蛋白和平滑肌肌動蛋白，而這些標志物的丟失在人類DCIS樣本中也得到證實，表明肌上皮細胞的分化在侵襲之前已被破壞，這些標志物的丟失可能是DCIS進展的一個標志。對人類活檢樣本的進一步研究發現，在DCIS的肌上皮細胞中，肌球蛋白重鏈和CD10的低表達與并發間質侵犯的風險有關[10]。因此，將人乳腺癌細胞-10與DCIS異種移植模型中具有低侵襲性表型的衍生物或其他細胞系進行比較，可能有助于識別腫瘤細胞釋放的旁分泌因子，旁分泌因子減少了肌上皮細胞分化標志物的表達，識別這些因子將幫助研究者發現DCIS入侵的其他潛在標志物。

1.2癌癥相關的成纖維細胞 正常成纖維細胞通過產生和重構ECM維持細胞外環境。癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)在促進腫瘤進展的過程中發揮了重要作用。CAFs具有異質性，其中一部分被鑒定為表達α平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細胞，其他被鑒定為表達成纖維細胞的激活蛋白、肌間線蛋白、S100A4蛋白等[11]。Orimo等[12]研究表明，CAFs可通過分泌基質細胞衍生因子-1/CXC趨化因子配體12促進腫瘤生長和腫瘤血管生成，CXC趨化因子配體12通過CXC趨化因子受體4以旁分泌的方式增加腫瘤細胞的增殖。肝細胞生長因子是另一種CAFs衍生因子，可通過c-Met受體酪氨酸激酶發揮作用，被認為是促進腫瘤進展和轉移的重要因子[13]。正常乳腺成纖維細胞與乳腺癌細胞共培養可促進成纖維細胞分泌肝細胞生長因子，并提高肝細胞生長因子的促腫瘤活性[14]。CAFs的起源已被廣泛研究，并提出了多種假設。一種是來源于天然間質成纖維細胞，其表型已被鄰近腫瘤上皮細胞持續異常的信號所改變；也可由骨髓來源的間充質干細胞分化，這些間充質干細胞在腫瘤衍生因子的刺激下被募集到腫瘤部位。從先前接受過同種異體骨髓移植的患者的腫瘤中鑒定出骨髓來源的細胞支持了這一假設[15]。但另一項研究表明，某些異種移植物通過激活和募集骨髓來源的細胞誘導弱致瘤細胞系的生長和轉移[16]，特別是表達顆粒蛋白的骨髓源性細胞，其既能促進腫瘤進展，也能促進成纖維細胞生長。這些數據以及來自其他實驗室的數據[17]支持了腫瘤源性信號刺激骨髓產生和釋放骨髓源性細胞，并促進腫瘤進展的這一假設。因此，靶向骨髓來源的細胞可能會影響局部和轉移性疾病的治療。

1.3白細胞 浸潤性白細胞在腫瘤的發展中發揮重要作用，但其介導免疫和腫瘤細胞串擾的機制卻鮮為人知。DCIS中存在大量浸潤性白細胞，伴有局灶性肌上皮細胞層破壞[18]，表明白細胞可能在侵襲性進展中發揮作用。研究發現，腫瘤相關巨噬細胞通過激活表皮生長因子受體，分泌蛋白酶以及激活腫瘤細胞間的旁分泌信號，促進血管生成、ECM降解以及腫瘤侵襲[19]。集落刺激因子-1缺陷小鼠丟失巨噬細胞對腫瘤的發生無影響，但大大減緩了惡性進程[20]。用小鼠集落刺激因子-1反義寡核苷酸或集落刺激因子-1小干擾RNA處理免疫缺陷小鼠中源自人乳腺癌細胞-7的異種移植物發現，其通過減少巨噬細胞浸潤、MMP和血管內皮生長因子-A的產生以及內皮細胞增殖，抑制乳腺腫瘤的生長[21]?？梢?，巨噬細胞在乳腺癌的進展過程中有重要作用，并為腫瘤相關巨噬細胞與不良臨床預后的關聯提供了合理解釋。除巨噬細胞外，其他免疫細胞也參與了乳腺癌的發展。在乳腺癌的小鼠模型中，使用白細胞介素-2免疫毒素融合蛋白后，CD4+T淋巴細胞的數量增加，且T細胞的系統性耗竭抑制了腫瘤生長，并維持強而持久的抗腫瘤免疫反應[22]。由于這些細胞是細胞介導免疫所必需，表明可能存在針對乳腺腫瘤的主動免疫反應，其強度可能會影響遠處轉移的風險。

1.4腫瘤進展中的基質重構 乳腺癌的ECM存在明顯異常，其可能促進了腫瘤進展。MMP主要由成纖維細胞合成，通常參與組織重構和切口愈合。除降解ECM外，MMP還可激活趨化因子、細胞因子、黏附分子以及生長因子，這些因子通過增加腫瘤細胞增殖或促進血管生成促進腫瘤進展[23]。乳腺腫瘤的異常生理特征(如異常膠原交聯導致ECM變硬)也會導致腫瘤進展。這種硬化產生的力量導致整合素和生長因子信號轉導增強，從而促進入侵。賴氨酰氧化酶是一種常見于乳腺腫瘤的胺氧化酶，在乳腺癌的MMTV-Neu模型中，其促進膠原蛋白交聯，增強ECM硬化，其抑制作用延緩了腫瘤進展，減輕了腫瘤負擔[24]。多項研究檢測了ECM對DCIS侵襲性的影響。Wallace等[25]認為，產后復舊是腫瘤進展的驅動力。產后復舊是斷奶后哺乳期乳腺恢復到懷孕前狀態的過程。復舊的乳腺和乳腺腫瘤微環境具有共同的特征，即促進腫瘤膠原蛋白表達、MMP上調、巨噬細胞浸潤以及血液和淋巴管重構。與未產患者和產后窗外診斷的患者相比，產后復舊患者更易患侵襲性疾病，并具有更高的轉移風險。信號蛋白-7a、環加氧酶-2和膠原蛋白均在復舊的乳腺中表達[25]，其共同作用使乳腺癌的無轉移生存率降低。另有研究表明，基質細胞中溶血磷脂氧化酶的高表達與ECM修飾酶家族的侵襲和轉移有關[26]。

2 表觀遺傳學

表觀遺傳學改變，即腫瘤細胞內基因表達的可遺傳改變，不涉及DNA序列的改變，也可以解釋目前在DNA序列水平上DCIS與IDC的差異。從正常乳腺上皮到DCIS，DNA甲基化通常會增加，但大部分研究發現，DCIS與IDC中啟動子的超甲基化水平相似[27-29]。這表明，DNA甲基化的改變是乳腺癌發生的早期事件。組蛋白修飾與DNA甲基化共同作用是基因調控的關鍵，賴氨酸特異性去甲基化酶(lysine specific demethylase，LSD)1是一種組蛋白甲基化擦除劑，作用于組蛋白H3K4和H3K9[30]。LSD1在乳腺腫瘤中高表達，在低、中、高級別DCIS與浸潤性乳腺癌中，LSD1的表達水平隨級別的增高而升高，再次表明乳腺癌進展中存在早期表觀遺傳事件[31]。DCIS和IDC均有其特異的基因甲基化。Melnikov等[32]采用微陣列甲基化分析方法發現，突變型p73、蛋白激酶C delta結合蛋白和mut S同種組織蛋白2基因的甲基化只與DCIS有關，與IDC無關；血小板反應蛋白l和脂肪酸結合蛋白3等基因的甲基化只與IDC有關,而與DCIS無關。近年來研究發現，MIMAS也在乳腺癌的進展中發揮關鍵作用，可以調控包括組蛋白去乙?；?、DNA甲基轉移酶和多梳蛋白在內的表觀遺傳修飾物[33]。

3 基因變異

IDC是最常見的乳腺癌類型，占乳腺癌病例的80%，而45%～78%的IDC與DCIS有關[34]。已有證據表明，DCIS是IDC的非專一性前體[1]，但用于區分DCIS和IDC的強大轉錄組或基因組特征仍在研究中。在研究過程中出現了兩種理論，在DCIS向侵襲性疾病轉變過程中選擇了具有特定遺傳變化的亞克隆，這導致DCIS與侵襲性樣本之間特異性擴增和突變患病率的差異[35]。與此同時，有學者提出了一種多克隆進化理論，該理論假設DCIS中的多個克隆在DCIS向IDC的過渡過程中共同遷移[36]。對癌前、浸潤前和IDC的基因表達譜進行分析表明，在轉錄組水平上，具有相同組織學分級的浸潤性病變和浸潤性乳腺癌的基因表達模式極為相似[37]。此外，增殖和凋亡相關蛋白雌激素受體和孕激素受體在DCIS和IDC的原位和侵襲性成分中有相似的表達模式，提示可能在轉化過程中發揮作用[38]。雖然DCIS和IDC在基因上相似，但在匹配的DCIS和IDC之間仍發現了一些質的差異。Kim等[39]通過全外顯子組測序和拷貝數分析確定了從DCIS到IDC的相關基因組改變，該研究發現了一些已知的突變，包括腫瘤蛋白p53基因、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞單位α以及蛋白激酶B1的突變和純DCIS中拷貝數的改變；但與同步DCIS-IDC相比，檢測到的基因突變與拷貝數的改變明顯減少。此外，Song等[40]通過分析GSE21422和GSE3893基因表達綜合數據集中DCIS和IDC的基因譜，探討導致DCIS向IDC發展的基因改變，從中共鑒定出26個保守的差異表達基因，其中FCGR2A、主要組織相容性復合體-DRA、補體成分3a受體1和FYB參與了DCIS向IDC的進展，人類白細胞抗原-DRA和FYB水平升高與乳腺癌復發有關，且FYB的過度表達與乳腺癌轉移有關。這些研究表明，至少在某些樣本中，通過達爾文選擇可能會發生從DCIS到IDC的進展。以上研究提高了人們對DCIS進展的認識，有助于識別潛在的進展標志物，尋求新的治療目標，從而開發出一種更加個性化的DCIS患者治療方法。

4 小 結

隨著DCIS發病率的增加,病理工作者需要提供重要病理信息以指導DCIS患者的治療決策，臨床工作者也需要更好地了解DCIS發生、發展的分子機制，以幫助患者選擇更好的治療方法。從DCIS到IDC的進展是一個非常復雜的分子事件，深度大規模平行測序和單細胞分析不僅提供了基因信息，同時也提供了一個詳細的關于腫瘤內和腫瘤間遺傳異質性和腫瘤演變過程的基因圖譜。目前，大規模平行測序的生物信息工具正在不斷的改進，這將有助于從大塊腫瘤群體測序中獲得更加詳細的信息，為識別體細胞的點突變提供更靈敏的方法。同時，研究發現了許多DCIS癌細胞中基因的改變、癌周環境的改變以及這些改變間的相互作用,這有助于更好地評估DCIS的發展,以期找出一個判斷DCIS是否會發展為IDC的綜合評定標準，從而指導臨床工作。