外泌體微RNA在三陰性乳腺癌中的研究進展

周聰，柴效科，肖惠，宋愛琳

(蘭州大學第二醫院普外科，蘭州 730030)

乳腺癌是女性最常見的癌癥，占女性患者新發癌癥的30%，2018 年國際癌癥研究機構發布的數據顯示，女性乳腺癌的發病率為46.3/10 萬，同時也是女性患者癌癥死亡的最主要因素，病死率為13.0/10 萬[1]。乳腺癌是一種由不同分子亞型組成的異質性疾病，其發生與多個基因突變有關，因此對于不同亞型的乳腺癌，應當采取不同的治療策略[2]。圣加侖會議共識將乳腺癌細分為Luminal A型、Luminal B型、人類表皮生長因子受體2陽性型和三陰性4種臨床亞型[3]。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)占乳腺癌的15%～20%，具有惡性程度高、侵襲轉移率大、化療藥耐藥性和預后差等特點[4]。目前，乳腺癌的診斷主要依靠患者自檢、影像學檢查和組織穿刺活檢，治療方式主要包括手術治療、化療、放療、新輔助治療及針對信號通路的靶向治療[5]。但傳統檢測手段不能及時發現早期病灶，導致患者在確診時可能已經發生了遠處轉移，且TNBC沒有明確的有效靶點，總體治療效果不佳，遠處轉移和不良預后是導致患者死亡的主要因素。因此，亟待尋找針對診斷早期病變的腫瘤標志物。越來越多的證據顯示，各種生物活性分子參與了乳腺癌的發展過程，如蛋白、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微RNA(microRNA，miRNA)等[6-8]?，F就近年來TNBC中外泌體miRNA的研究予以綜述，以期為臨床診斷和治療的潛在價值提供新發現。

1 外泌體miRNA

外泌體作為一種胞外運載工具，是一種直徑為40～100 nm的膜性囊泡，它可以由多種細胞產生。外泌體的產生源于細胞膜內吞形成早期的胞內小體，裝載多種胞內物質形成胞內多泡體，最后通過胞吐作用釋放到細胞外形成外泌體，存在于尿液、羊水、唾液、腹水、腦脊液、外周血等其他體液中[9-12]。外泌體于1985 年首次發現，被認為是一種無生物活性的運輸載體[13]。從1996年發現B細胞分泌外泌體可以促進T細胞的增殖開始，有學者猜測外泌體可以作為一種新的細胞間交流途徑，供細胞之間傳遞多種生物活性分子，如脂質、蛋白質、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、lncRNA及miRNA[14-19]。miRNA首次發現于線蟲中，是一種高度保守的單鏈非編碼RNA，包括17～25個核苷酸，在轉錄后階段與mRNA的3′非翻譯區結合，負性調節人類基因組中30%的基因表達，調節過程涉及3種可能的機制：抑制翻譯啟動、啟動后抑制翻譯和使目標mRNA不穩定，導致mRNA的降解或翻譯抑制[20-21]。一個miRNA可以匹配多個mRNA，執行多種生物活性。miRNA可存在于多種生物體液中，與癌細胞的增殖、凋亡、免疫逃逸、侵襲轉移和化療藥耐藥性有密切聯系[22-26]。近年來，研究發現外泌體可裝載傳遞miRNA至鄰近細胞執行功能、調節腫瘤的發生發展[27]。在癌細胞中產生的外泌體數量多于正常細胞，并且外泌體攜帶生物活性分子存在于多種體液中，因此將外泌體作為腫瘤檢測的非侵入性生物標志物具有較大的潛在價值[28]。

2 外泌體miRNA在TNBC細胞增殖中的研究

癌細胞增殖增加和凋亡減少有助于腫瘤的發生和進展，外泌體可以被傳遞至正常的細胞，促使正常細胞轉變為癌細胞，改變其增殖和凋亡狀態。Melo等[29]發現，將正常乳腺上皮細胞和MDA-MB-231乳腺癌細胞分泌的外泌體共同培養后可表現出更強的細胞活力，而這種細胞活力可以被Dicer酶破壞，該酶是一種核糖核酸內切酶，能降解癌細胞傳遞的miRNA前體，說明癌細胞分泌的外泌體中有能改變細胞活力的miRNA存在。研究證明，在MDA-MB-231乳腺癌細胞中外泌體miR-1246多于其他乳腺細胞[30]。同樣在16例乳腺癌患者中學者也發現，miR-1246以相對高的濃度富集于患者的血漿中，miR-1246通過外泌體的運輸進入正常細胞，抑制細胞周期蛋白G2的表達，細胞周期蛋白G2是一種抑癌基因，其表達水平和患者預后呈負相關，雖然這16例病例并不完全是TNBC患者，但也說明了在外周血中能夠利用外泌體miRNA判斷患病風險和疾病預后的可能性，而在TNBC中miR-1246是否豐富仍需要進一步研究證明[31]。另外，在癌細胞中高水平表達的外泌體miR-21和miR-10b也能通過抑制抑癌基因(人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和同源異形盒D10)增強受體細胞的增殖能力[32-33]。癌細胞可以分泌促腫瘤miRNA，正常細胞也能分泌抑制腫瘤的miRNA來改變腫瘤細胞的生存狀態。外泌體miR-503在正常乳腺細胞中分泌較多，而在TNBC細胞中分泌較少，它和腫瘤進展相互克制，高表達的miR-503可以抑制TNBC細胞的細胞周期素D2和D3表達，細胞周期素D2和D3是細胞周期蛋白的正向調節蛋白，其擴增可能導致細胞周期蛋白異?；罨?、細胞周期紊亂，加速腫瘤的發生發展[34]。且在經過新輔助化療的乳腺癌患者的血漿中，能檢測到更多的miR-503，故其或許能成為一種提示乳腺癌患者預后的標志物。

3 外泌體miRNA在TNBC血管生成中的研究

血管生成是腫瘤發生、發展以及轉移的重要條件。腫瘤血管生成需要腫瘤微環境中多種成分，包括促血管生成因子和抗血管生成因子，前者包括血管內皮生長因子、胎盤生長因子、血小板源性生長因子、表皮生長因子，后者包括血管抑素、內皮抑素、金屬蛋白酶組織抑制物以及α干擾素等。因此，針對血管生成的靶點開發新藥是抗腫瘤藥研究的熱門方向。二十二碳六烯酸是一種具有抗血管生成特性的天然化合物，可作為乳腺癌防治的膳食補充劑。Hannafon等[35]分離收集了經過二十二碳六烯酸處理的MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞的外泌體，在這類外泌體中let-7a、let-7、miR-21、miR-23b、miR-27a/b和miR-320b等表達較多，而這些miRNA具有抗血管生成、抗腫瘤的作用。用腫瘤細胞外泌體共培養內皮細胞后，miR-23b和miR-320b的表達減少，抗血管生成相關的基因表達減少，且能觀察到管腔的形成，敲除外泌體釋放相關的蛋白(如Rab GTP酶和Rab27A)可阻斷這種促血管生成效應。另外，正常細胞來源的外泌體中包含多種作用于血管生成靶點的miRNA(如間充質干細胞來源的外泌體miR-100)可以通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/缺氧誘導因子-1α信號軸減少TNBC細胞血管內皮生長因子和血管內皮生長因子受體1蛋白的表達，抑制腫瘤血管生成，對抗癌細胞的侵襲能力[36]。此外，間充質干細胞中的外泌體miR-16也能抑制4T1乳腺癌細胞的血管內皮生長因子表達，抑制腫瘤血管形成[37]。外泌體miRNA不僅能抑制腫瘤血管形成，腫瘤細胞來源的外泌體miRNA還能促進腫瘤的發展。低氧狀態下，TNBC細胞能分泌更多的外泌體、表達更高水平的miR-210[38-39]。有研究表明，miR-210與腫瘤轉移有密切聯系，癌細胞通過外泌體將miR-210傳遞給內皮細胞，促進腫瘤新生血管形成和癌癥發展[40]。

4 外泌體miRNA在TNBC免疫過程中的研究

近年來，乳腺癌免疫療法成為腫瘤治療的新方向，一項Ⅲ期臨床試驗結果表明，程序性細胞死亡配體1抑制劑聯合白蛋白紫杉醇可明顯延長程序性細胞死亡配體1陽性TNBC患者的生存時間，另外程序性細胞死亡受體1抑制劑聯合細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑、雄激素受體調節劑在Ⅰ期或Ⅱ期臨床試驗中也表現出良好的效果，證明乳腺癌免疫療法具有良好的前景[41]。因此，研究外泌體miRNA在腫瘤免疫中的作用，對理解其在TNBC中的診治價值具有重要意義。外泌體miRNA在腫瘤細胞和免疫細胞兩種完全不同的細胞之間互相傳遞，一方面可以促進腫瘤的發生發展，另一方面又可以抑制腫瘤的進展，其功能主要取決于傳遞miRNA的種類。在TNBC中，腫瘤相關巨噬細胞分泌的miRNA不僅與癌細胞的侵襲轉移能力相關，而且與患者的預后關系密切[42]。通過微陣列分析發現，miR-223在巨噬細胞中高表達，而在TNBC中低表達，當癌細胞與巨噬細胞來源的外泌體共培養后，miR-223可運輸至腫瘤細胞增強乳腺癌細胞的侵襲能力[43]。同時，乳腺癌細胞來源的外泌體也能通過核因子κB途徑誘導炎癥反應，促進腫瘤的發展[44]。另外，miR-16不僅能抑制腫瘤血管的形成，還參與了腫瘤免疫過程。Jang等[45]研究表明，綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯可促使4T1乳腺癌細胞中miR-16高表達，外泌體將miR-16運輸至巨噬細胞，抑制腫瘤相關巨噬細胞的滲透，誘導巨噬細胞向具有腫瘤抑制功能的M1型分化。

5 外泌體miRNA在TNBC細胞侵襲轉移中的研究

腫瘤轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因，乳腺癌最常見轉移的部位包括肺、肝、骨和皮膚，探究乳腺癌如何增強癌細胞的侵襲性對于改善患者預后和生活質量具有重要意義[46]。尤其對于TNBC，其惡性程度更高、轉移概率更大、患者預后更差，研究TNBC轉移機制在臨床上有切實意義。在63例TNBC患者中，外泌體miR-939呈高表達狀態，其作用于鈣黏蛋白，增加內皮細胞的滲透性[27]。在細胞實驗中，MDA-MB-231 TNBC細胞表達的外泌體miR-939能下調鈣黏蛋白，導致內皮細胞屏障的破壞和腫瘤轉移，而miR-10b的表達與轉移的發生率相關[47]。癌細胞來源的外泌體miR-10b能作用于正常乳腺上皮細胞的同源異型盒基因D10和krupple樣因子4基因，增強其侵襲能力[48]。外泌體miR-105能下調內皮細胞的閉鎖小帶蛋白1基因表達，破壞內皮細胞之間的連接和屏障功能，增加血管通透性，以致乳腺癌細胞更易外滲至遠處器官[49]。外泌體miR-181c能靶向作用于內皮細胞中的3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1，導致肌動蛋白動力學和纖維排列異常，減弱細胞間緊密連接，促使乳腺癌腦轉移[50]。除了促腫瘤效應的miRNA外，也有其他miRNA能夠發揮抑制腫瘤進展的作用。外泌體miR-770能抑制MDA-MB-231細胞和MDA-MB-468細胞的上皮-間充質轉化途徑，從而降低癌細胞的侵襲能力[51]。另外，外泌體miR-134、miR-205、miR-31也可下調TNBC細胞的轉移侵襲能力[52-53]。

6 外泌體miRNA在TNBC細胞耐藥中的研究

蒽環類、環磷酰胺、紫杉烷類是大多數乳腺癌治療化療方案的基礎藥物，而腫瘤化療耐藥是導致乳腺癌患者治療失敗的普遍原因，其機制可能涉及藥物靶點的突變、藥物快速清除和藥物轉運改變等。一些外泌體miRNA已被證實可調節乳腺癌細胞對化療藥物的化療耐藥性[54-55]。在多西他賽、表柔比星、長春新堿耐藥的MDA-MB-231細胞的外泌體表達譜中，可檢測到miR-4443、miR-574-3p、miR-7847-3p、miR-423-5p、miR-4298、miR-3178、miR-6780b-3p、miR-7107-5p、miR-744-5p、miR-4258、miR-138-5p和miR-210-3p的表達水平明顯上調[56]。另外也有研究表明，外泌體miR-1246可以抑制細胞周期蛋白G2，增強TNBC細胞對多西他賽、表柔比星、吉西他濱的耐藥性[30]；外泌體miR-134可以增強癌細胞對鉑類藥物和抗熱激蛋白藥的敏感性[52]；外泌體miR-770能抑制癌細胞對多柔比星的耐藥性[51]?；|細胞來源的外泌體也能影響腫瘤細胞對化療藥的耐藥性，如基質細胞分泌的外泌體miR-127、miR-197、miR-222和miR-223能抑制TNBC基質細胞衍生因子1的表達，并將癌細胞阻滯在G0期[57]?；|細胞衍生因子1是一種趨化因子，與其受體CXC趨化因子受體4結合能促進腫瘤的生長、轉移，但是進入靜止期的癌細胞在基質細胞衍生因子1表達受抑制時，卻能增強對化療藥的耐藥性。

7 靶向外泌體miRNA的治療方法

外泌體miRNA在癌癥進展中的重要作用不容忽視，因此研發關鍵miRNA的新藥意義重大。據報道，一些臨床抗癌藥物的機制也部分依賴于外泌體miRNA，D-鼠李糖β常春藤是一種三萜系化合物，能減少外泌體的釋放，進而降低miR-130a和miR-425水平，抑制癌細胞的生長[58]。同樣紫草素也能抑制外泌體釋放，減少miR-128表達，抑制癌癥發展[59]。另外，二十二碳六烯酸可以作為乳腺癌防治的一種膳食補充劑，能增強let-7a、let-7、miR-21、miR-23b、miR-27a/b和miR-320b等miRNA表達，減少促血管生成相關蛋白表達[35]。

8 小 結

腫瘤無創診斷技術在未來很可能蓬勃發展，外泌體miRNA的實驗研究對其臨床無創診斷價值提供了很好的評估，同時也給腫瘤治療帶來新的方向，或阻斷外泌體中促腫瘤型miRNA的包裝、釋放，或降低其生物活性、耗竭外周循環中的miRNA。但現階段釋放和靶向運輸機制尚未得到明確的闡釋，且外泌體囊泡如何選擇特定的miRNA包裝仍不清楚，應用到臨床也有一些問題需要解決(如快速分離和純化)。目前分離外泌體最普遍的方法為超速離心法，然后檢測其直徑大小，蛋白免疫印跡法雖可測定表面生物標志物(如膜蛋白CD63、CD81、CD9)，但因其分離成本高、耗費時間長、純度不高，故臨床未能普及[60]。檢測miRNA時，可采用RNA測序或實時定量聚合酶鏈反應等實驗方法，但在操作過程中，隨著時間的推移miRNA很容易被降解，對結果的準確性產生極大影響。目前，越來越多的文獻報道了外泌體分離和檢測的新技術。Lewis等[61]報道了利用交流電保留外泌體、剔除其他顆粒雜質的技術，并利用外周血的外泌體進行了胰腺癌的篩查，整個篩查過程不超過1 h，大大縮減了外泌體實驗技術的時間。另外，Ko等[62]利用軌道蝕刻磁性納米孔技術分離外泌體，進行胰腺癌的診斷；Lamichhane等[63]利用聲波將干擾小RNA裝載進胞外囊泡顆粒中?？傊?，外泌體在腫瘤領域的發現不斷被豐富，且其在體內運輸的精準性也不斷提高，故外泌體miRNA很可能成為一種新的腫瘤檢測和靶向治療方案。