hairy和hedgehog在單環刺螠幼蟲體節形成過程中的表達特征分析?

李 琦， 秦貞奎， 張婷婷， 魏茂凱， 侯西坦， 張志峰

(中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

Hariy是Hes家族成員，其作為Notch信號通路的下游靶基因，參與神經和體節的發育以及免疫和癌癥等生物學過程[1]。hairy參與體節形成已經在幾種昆蟲中被驗證[2-6]；在環節動物小頭蟲(Capitellateleta)中hairy/hes1定位于體節產生區域，被認為可能參與了體節形成過程[7]；在有爪動物櫛蠶(Euperipatoideskanangrensis)中，盡管hairy呈現條帶狀表達圖式，但因其在胚胎末端體節發生區域不表達，因而被認為與體節形成無關[8]。

Hedgehog作為其信號通路中的配體參與眾多發育過程，如細胞增殖與定向分化，組織形態發生和體節極性維持等[8]。在果蠅(Drosophilamelanogaster)中，其首先被證明作為一種體節極性基因參與副體節和體節邊界的界定與維持[10]，相同的功能也在螯肢動物歐洲黃色尾蝎(Euscorpiusflavicaudis)、甲殼動物鹵蟲(Artemiafranciscana)以及環節動物褐片闊沙蠶(Platynereisdumerilii)中被驗證[11-12]。

單環刺螠(Urechisunicinctus)隸屬螠蟲動物門(Echiura)，主要分布于遠東地區，是一種海洋經濟無脊椎動物。其胚胎孵化后，歷經擔輪幼蟲、體節幼蟲、蠕蟲狀幼蟲，然后變態成為幼螠；在由晚期擔輪幼蟲發育至早期體節幼蟲的過程中產生體節，在由體節幼蟲發育至蠕蟲狀幼蟲的過程中體節消失(見圖1)。謝躍洋報道單環刺螠的幼蟲體節僅是表皮分節[13]，這一特點與典型體節動物(節肢動物和環節動物)終生存在的體節不同，典型體節動物除了表皮分節外，其內部主要組織器官(體腔、肌肉、循環系統、排泄系統等)均按節重復排布[14-15]。為了探討螠蟲動物幼蟲體節和典型體節動物體節發生和功能維持中的基因調控以及進化關系，本研究以hairy和hedgehog為靶基因，揭示了它們在單環刺螠幼蟲體節形成過程中的表達特征。旨在為探究螠蟲動物幼蟲體節發生的分子機制和進化等研究提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

單環刺螠成體來自山東省萊州灣。挑選腎管飽滿的雌、雄個體(平均體重為(28.7±8.6) g)，解剖并獲取成熟的兩性配子，以精卵比例10∶1進行體外人工授精。將受精卵置于盛有200 L過濾海水的培養箱(855 mm×650 mm×595 mm)中進行孵化(水溫為17.2 ℃，pH=7.8 ± 0.06，鹽度為29 ± 1)和前期培育。受精后24 h孵出擔輪幼蟲，投喂以小球藻(Chlorellavulgaris)和牟氏角毛藻(Cheatocerosmuelleri)，每天早晚分別投餌一次，并隨著幼蟲發育逐漸增加投餌量；至晚期體節幼蟲轉入泥沙底質(厚約6 cm)中繼續培養。培養期間，定期于顯微鏡下觀察幼蟲的發育，并取中期擔輪幼蟲(受精后10 d)、晚期擔輪幼蟲(受精后25 d)、早期體節幼蟲(受精后30 d)，體節幼蟲(受精后33、37和40 d)和蠕蟲狀幼蟲(受精后45 d)于4%多聚甲醛中固定過夜，經梯度甲醇脫水后保存于無水甲醇中(-20 ℃)，用于整體原位雜交。

(A：受精卵；B：囊胚；C：原腸胚；D：早期擔輪幼蟲(消化道打通之前)；E：中期擔輪幼蟲(消化道打通)F：晚期擔輪幼蟲(腹側體壁增厚)；G：早期體節幼蟲(腹側體壁分節)；H～I：體節幼蟲(完全分節)； J：蠕蟲狀幼蟲(分節消失)。E～H為側視圖；I和J為背視圖；星號示意口；左上角數字為受精后時間。A: Fertilized egg; B: Blastula; C: Gastrula; D: Early-trochophore larva (Before the digestive gut opening); E: Mid-trochophore larva (The digestive gut opening); F: Late-trochophore larva (With the thickened ventral body wall); G: Early-segmentation larva (With the segmented ventral body wall); H～I: Segmentation larva (With the complete segments); J: Worm-shaped larva (The segments disappeared). E～H Are ventral view; I & J Are dorsal view. The asterisks point to the mouth. The top left number of each picture is the post fertilization time.)

圖1 單環刺螠早期發育

Fig.1 The early development ofU.unicinctus

1.2 總RNA提取和cDNA合成

收集晚期擔輪幼蟲約100只，使用MicroElute?Total RNA Kit (Omega, 美國)并按照操作指南提取其總RNA；使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa, 大連)并按照操作指南將總RNA反轉錄為cDNA，用于靶基因ORF擴增。

1.3 Uu-hairy ORF擴增及序列分析

從單環刺螠幼蟲轉錄組中獲得hairycDNA 片段序列，設計ORF擴增引物(見表1)。以上述cDNA為模板，PCR擴增獲得其ORF全長序列，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收、連接pClone007載體、轉化大腸桿菌DH5α后，挑取單菌落進行PCR驗證，然后送往華大基因測序。使用DMAMAN軟件對Hairy蛋白進行氨基酸多序列比對，通過NCBI在線BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行同源性分析，使用MEGA 7.0 軟件采用Neighbor Joining法構建進化樹，Bootstrap設置為1 000。

1.4 目的基因定量表達分析

從單環刺螠幼蟲轉錄組中挑出靶基因，以它們的FPKM值作為表達量，計算各發育時期幼蟲(晚期擔輪幼蟲(L，受精后25 d)，早期體節幼蟲(E，受精后30 d)，體節幼蟲(S，受精后35 d)和蠕蟲狀幼蟲(W，受精后42 d))中FPKM的平均值(n=3)。使用SPSS Statistic軟件并采用單因素方差分析(One-Way ANOVE)和Tukey’s HSD檢驗法對各期幼蟲靶基因的表達量進行統計分析，顯著性差異水平設定為P<0.05。

1.5 整體原位雜交

根據單環刺螠hariy(GenBank序列號：MK353161)和hedgehog(GenBank序列號：KY773909)ORF序列設計探針合成引物(見表1)，PCR擴增分別獲得長度為436 bp (Uu-hariy)和487 bp(Uu-hedgehog)的序列。以該序列為模板，使用DIG RNA Labeling kit(Roche，瑞士)并按照操作指南合成地高辛標記的RNA 正義和反義探針。取保存于無水甲醇中的各時期幼蟲，經梯度甲醇復水后于100 ng/mL蛋白酶K 37 ℃消化20 min(擔輪幼蟲)或者400 ng/mL蛋白酶K 37 ℃消化30 min(體節幼蟲)；預雜交條件為60 ℃下6 h，然后加入DIG標記的RNA探針于60 ℃雜交過夜；經過洗滌和blocking buffer封閉后，加入DIG抗體4 ℃孵育過夜；再于NBT/BCIP體系中顯色；最終樣本于Nikon E80i 顯微鏡下觀察和拍照。

表1 本研究中所用引物序列

2 結果

2.1單環刺螠hairy的序列特征分析

由于周頔[16]已報道了單環刺螠hedgehog的序列特征，因此本研究僅對單環刺螠hairy的序列特征進行分析。

單環刺螠hairy開放閱讀框(Open reading frame，ORF)長度為888 bp，編碼295個氨基酸。多序列比對結果顯示，單環刺螠預測蛋白的氨基酸序列中含有Hairy蛋白保守的HLH結構域、Hairy_Orange結構域和保守的四肽WRPW(見圖2)。

(HLH結構域、Hairy_Orange結構域和保守四肽WRPW分別用方框標記。HLH motif, Hairy_Orange motif and tetrapeptide WRPW are boxed.)

同源性分析表明，Uu-Hariy蛋白與小頭蟲(C.teleta)和黑腹果蠅(D.melanogaster)的Hairy序列一致性分別為69%和57%；與脊椎動物人(Homosapiens)和斑馬魚(Daniorerio)的序列一致性均為54%。系統進化分析發現Uu-Hairy首先與小頭蟲Hairy聚為一簇，隨后與其他物種Hairy聚合，最后與Hes家族聚合(見圖3)。

圖3 不同物種Hes家族蛋白系統進化分析

2.2 hairy和hedgehog在單環刺螠幼蟲中的定量表達

單環刺螠的幼蟲體節是在晚期擔輪幼蟲向早期體節幼蟲發育過程中形成的；在由早期體節幼蟲發育至體節幼蟲期間，幼蟲體節逐漸完善；在由體節幼蟲向蠕蟲狀幼蟲的發育過程中幼蟲體節消失。分析單環刺螠幼蟲轉錄組中hairy和hedgehog的FPKM值，發現兩個靶基因在四個發育時期幼蟲中均表達，其表達量均隨幼蟲發育逐漸升高。其中hairy在早期體節幼蟲中的表達量較晚期擔輪幼蟲顯著增加，約提高1.4倍，之后的各期幼蟲中未見顯著差異；hedgehog在體節幼蟲中的表達量較早期體節幼蟲顯著增加，約提高1.3倍(見圖4)。

2.3 hairy和hedgehog在單環刺螠幼蟲中的定位表達

整體原位雜交結果顯示，單環刺螠hairy和hedgehog的mRNA均在中期擔輪幼蟲纖毛環和口處呈現明顯的陽性信號(見圖5 A1、A2)；至晚期擔輪幼蟲，靶基因在其下半球處呈現條帶狀表達模式(見圖5 B1、B2)，這種條帶狀分布特點一直維持到體節幼蟲，并且隨著發育表達條帶更加清晰(見圖5 C1～F1、C2～F2)；至蠕蟲狀幼蟲，靶基因的條帶狀表達模式消失，轉而彌散于體壁及消化道處(見圖5 G1、G2)。但未見hairy的體節間隔式表達特征。

(L：晚期擔輪幼蟲；E：早期體節幼蟲；S：體節幼蟲；W：蠕蟲狀幼蟲；所有數據均為平均值(n=3)，同一基因不同字母表示不同時期幼蟲中的表達量存在顯著性差異(P<0.05)。L: late-trochophore larva; E early-segmentation larva; S: segmentation larva; W: worm-shaped larva; Date are indicated as the mean from three independent samples with duplicates. For each gene, different letters indicate significant differences(P<0.05)among the larvae at the different stages.)

圖4 單環刺螠幼蟲發育過程中hairy和hedgehog的表達量

Fig.4 Expression levels ofhairyandhedgehoginU.unicinctusduring the larval development

(A：中期擔輪幼蟲；B：晚期擔輪幼蟲；C：早期體節幼蟲；D～F：體節幼蟲；G：蠕蟲狀幼蟲。A～E：腹面觀，F、G：側面觀。星號指示口的位置。A: mid-trochophore larva; B: late-trochophore larva; C: early-segmentation larva; D～F: segmentation larva; G: worm-shaped larva. A～E are ventral view; F & G are lateral view. The asterisks point to the mouth.)

圖5hairy和hedgehog在單環刺螠幼蟲中的原位雜交檢測

Fig.5 Location ofhairyandhedgehogmRNA inU.unicinctuslarvae detected by whole mountinsituhybridization

3 討論

本研究獲得的單環刺螠靶序列 ORF全長888 bp，其預測氨基酸序列中含有Hes家族蛋白保守的HLH結構域(與DNA結合后調節轉錄)、Hairy_Orange結構域(調節Hes蛋白異源二聚體形成)和C端保守四肽(轉錄抑制域)；同時還具有Hairy的保守特征，即：在其HLH結構域第6位是脯氨酸，其C端四肽是WRPW[2,5,7]；初步確定本研究獲得的靶序列是單環刺螠hairyORF全長。比較不同物種Hariy保守結構域的氨基酸序列一致性發現，HLH結構域序列的保守性高于Hairy_Orange結構域；反映了與DNA結合并調控轉錄的HLH結構域在各物種間更加保守，而調節Hes蛋白二聚體形成的Hairy_Orange結構域序列則具物種間特異性。進一步分析發現，單環刺螠Hairy的HLH結構域、Hairy_Orange結構域以及整個氨基酸序列均與環節動物小頭蟲對應序列之間的一致性最高，分別為81.03%、57.14%和69%，提示單環刺螠可能與環節動物小頭蟲親緣關系最近。

hairy調控體節發生的功能已在多種節肢動物中報道。在長胚基昆蟲果蠅(D.melanogaster)中，hairy呈現體節間隔的表達模式，由此被定義為成對控制基因[2-4]。然而，在短胚基昆蟲雜擬谷盜(Triboliumconfusum)和中胚基昆蟲白腹皮蠹(Gryllusbimaculatus)以及多足綱球馬陸(Glomerismarginata)和蛛形綱游走蛛(Cupienniussalei)中，hairy定位于每一個體節中，而非果蠅中的間隔體節表達特征[5-6, 17-19]。在環節動物沙蠶、小頭蟲和有爪動物櫛蠶中，hariy/hes也呈現按節分布的條帶狀表達模式[7-8, 20]，可見大部分體節物種中hairy均呈現按節分布的表達特點。本研究結果顯示，單環刺螠hairy自晚期擔輪幼蟲開始便呈現條帶狀表達，至體節幼蟲時定位于每一個幼蟲體節的邊界處。這一表達特征與中、短胚基昆蟲、有爪動物和環節動物等典型體節動物中的表達模式基本一致，但不同于果蠅中的體節間隔表達模式。

Bianchi-Frias等[4]揭示，在hairy突變的果蠅中，hairy下游基因表達區域擴大并失去體節極性，導致全部體節不能發生；在雜擬谷盜中，hairy調控其頭節分化與發育[5]；在白腹皮蠹中，hairy則調控腹節形成[6]。在環節動物小頭蟲中，hairy/hes1信號定位于體節形成區域，并略早或同步于體節形成過程，因而被認為可能參與其體節形成[7]；在有爪動物櫛蠶中，hairy信號并不定位于胚胎末端的體節形成區域且其條帶狀信號出現時體節已經形成，因而被認為不參與體節形成[8]。在單環刺螠幼蟲體節形成過程中，條帶狀hairy信號早于體節形成過程出現并主要定位于即將形成體節的幼蟲下半球，這與小頭蟲中情況較為一致；由此，本研究者推測hairy可能參與了單環刺螠幼蟲體節形成過程。然而，hairy在單環刺螠幼蟲體節形成過程中所發揮的具體功能及調控區域尚不明確，仍需后續實驗驗證。

在節肢動物和環節動物中，hedgehog定位于副體節或體節的邊界處，參與體節邊界的界定和維持，由此被確定是一個保守的體節極性基因[9-12]。本研究結果顯示，hedgehog在單環刺螠尚未發生形態可見的幼蟲體節之前(晚期擔輪幼蟲)便呈條帶狀表達特征，當發育至體節幼蟲時其定位于幼蟲體節的邊界。提示hedgehog在單環刺螠幼蟲體節中的功能與已報道典型體節物種中的功能一致，即參與幼蟲體節的邊界維持[12]。

謝躍洋[13]基于組織學觀察發現，單環刺螠幼蟲體節形成模式類似于小頭蟲的側增殖帶法，據此提出單環刺螠與環節動物小頭蟲親緣關系最近。本研究通過對單環刺螠hairy和hedgehog序列特征及其在幼蟲體節發生過程中的表達圖式分析，發現其均與環節動物小頭蟲的特征最接近，本研究結果也謝躍洋的觀點一致。