后抗生素時代的輔助抗菌策略研究進展

劉暢，沈瀚

南京大學醫學院 附屬鼓樓醫院，江蘇 南京 210008

抗生素是人類醫學史上最偉大的成就之一，其廣泛應用曾一度使人類暫時擺脫了感染性疾病的威脅，開創了人類抗感染治療的新紀元。然而，抗生素的大量使用導致多重耐藥細菌比例正呈現逐年上升態勢，新型細菌耐藥機制正不斷涌現，嚴重危害了患者的生命健康安全。更為嚴峻的是，傳統抗生素研究自上世紀60年代以來已進入瓶頸期，新型抗菌藥物的研發進度已經逐漸落后，人類正被迫走向“后抗生素時代”。在這一背景下，能夠與傳統抗生素相結合、通過多種方式提高抗感染治療效率的輔助抗菌策略成為最近幾年的研究熱點。

1 增強細菌外膜的藥物通透性

細菌外膜位于革蘭陰性菌肽聚糖層外側，對于通過物質的分子大小、電荷、空間位阻具有選擇性，是細菌抵抗抗菌藥物的第一道防線。不僅如此，研究還表明細菌外膜的物理強度也遠超于傳統認知，在細菌肽聚糖層受損時能夠承擔一部分結構支撐作用[1]。細菌在外膜受損時生存能力較差，Tran等發現在使用多粘菌素破壞細菌外膜后，抗腫瘤藥物米托坦（mitotane）獲得了十分顯著的抗菌能力，即使對于多粘菌素耐藥菌株也具有較好的療效。該現象出現的原因目前仍有待探討，研究認為可能與米托坦在細菌外膜受損后大量進入細菌內部有關[2]。盡管目前米托坦的抗菌機制尚不清楚，但由于多粘菌素-米托坦這一用藥組合明顯區別于臨床常用抗菌藥物，細菌尚未獲得相應的耐藥能力，因此在使用這一方案應對臨床多重耐藥細菌時能夠取得較為理想的治療效果[2]。以多粘菌素為代表的陽離子抗菌多肽對于細菌外膜具有破壞作用，是傳統抗菌藥物的理想“擴增器”。多粘菌素衍生物SPR741不僅在體外實驗中能夠有效降低多重耐藥大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌的治療難度，在體內實驗中也能夠顯著提高受感染實驗動物的生存率，目前已進入Ⅰ期臨床試驗，其臨床應用價值未來可期。

2 抑制細菌外排泵活性

外排泵是能夠將細菌胞內藥物或毒性物質排出胞外的蛋白轉運系統，是細菌在抗生素壓力下維持生存的重要機制之一。目前已知的細菌外排泵系統可根據氨基酸序列和底物類型分為5個超家族，它們分別是ATP結合盒超家族（ATP-inding cassette superfamily，ABC）、主要促進劑超家族（major facilitator superfamily，MFS）、耐藥結節化細胞分化家族（resistance nodulation division family，RND）、小多重耐藥轉運分子家族（small multidrug resistance family，SMR）和多藥及毒性化合物外排分子家族（multiantimicrobial and toxic compound extrusion，MATE），其中以 RND 家族在多重耐藥細菌中的分布最為廣泛。

使用外排泵抑制劑降低多重耐藥細菌耐藥性的相關研究已較為深入，羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanide mchlorophenylhydrazone，CCCP）屬于外排泵能量阻斷劑，可在穿過細菌磷脂雙層后解離并釋放質子，通過破壞細菌的跨膜電化學梯度降低細菌外排泵活性[3]；苯丙氨酸-精氨酸-β-萘酰胺（phenylalanyl-arginyl-β-naphthylamide，PAβN）通過競爭抑制細菌外排泵活性顯著提高革蘭陰性菌外膜通透性，與喹諾酮類抗生素聯用時能夠有效降低銅綠假單胞菌的治療難度[4,5]；部分喹啉衍生物（quinoline）被證明對于產氣腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌外排泵活性具有抑制作用，研究認為其作用機理可能與其在該菌AcrAB-TolC外排泵洞穴結構中形成空間位阻，從而干擾底物的運輸過程有關[6-9]。此外，許多天然植物成分也具有明顯的細菌外排泵抑制活性，可以協同增強抗生素的抗菌作用[10-11]。然而，由于受到穩定性、安全性、特異性、藥代動力學特征等問題的限制，現有外排泵抑制劑在有效劑量下通常表現出較高的細胞毒性，目前尚沒有成熟的外排泵抑制劑能夠投入臨床使用，外排泵抑制劑的相關研究仍有待深入[12-14]。

3 切斷細菌的群體感應系統

細菌群體感應（quorum sensing，QS）系統是一類細菌通過分泌自誘導物（autoinducers，AIs）與環境中其他細菌進行通訊，從而特異性調節部分細菌生理學功能的調控系統，已被證明廣泛參與細菌的生物發光[15]、生物膜形成[16]、毒素釋放[17]、運動性[18]以及芽孢形成[19]等過程，是影響細菌多種生命活動的重要調節機制之一，因此也是新型輔助抗菌藥物研發的理想作用靶點。

目前已知的細菌QS系統包括LasI/LasR系統、RhlI/RhlR系統，以及銅綠假單胞菌喹諾酮信號系統（Pseudomonasquinolone signal，PQS）等，其中前兩者屬于LuxI/LuxR型，在革蘭陰性菌中的分布最為廣泛[20]。LasI/LasR系統一般依靠細菌自身合成的3-氧十二烷酰高絲氨酸內酯（3-O-C12-HSL）或丁基高絲氨酸內酯（C4-HSL）作為AI，并在環境中AI達到閾值濃度時刺激轉錄激活因子LasR合成AI受體，從而直接或間接完成細菌基因表達水平調控過程?；诖嗽?，有研究對3-OC12-HSL的五元內酯環和酰胺側鏈進行化學修飾，從而達到競爭抑制LasR受體，阻斷信號傳遞的目的[21]；Colleen等發現溴化硫代內酯（meta-bromo-thiolactone）因其結構與3-OXO-C12-HSL相似而能夠同時阻斷銅綠假單胞菌的LasR和RhlR系統，導致細菌毒性下降[16]；黃酮類化合物可利用其結構中A環主鏈中的2個羥基有效抑制銅綠假單胞菌LasR/RhlR系統的活性，生物化學分析表明黃酮類化合物非競爭抑制LasR/RhlR系統與DNA的結合，從而抑制細菌毒力因子的產生[22]。此外，部分傳統藥物也被證明對細菌QS具有一定的干擾作用。布洛芬能夠有效抑制細菌的QS系統[23]；阿奇霉素可通過干擾QS系統降低銅綠假單胞菌毒素的產生[24]；氨溴索通過干擾QS系統抑制細菌生物膜生成[25]；阿司匹林可作為LasR的競爭性抑制劑顯著降低實驗菌株的毒素產量和生物膜形成速度[26]。

細菌QS系統種類繁多，不僅一種細菌可同時編碼多個QS系統，并且許多細菌常具有自己獨特的QS系統，極大地增加了廣譜QS抑制劑的研發難度。即使是部分已知的QS抑制劑，其有效成分、作用靶點、作用機制等關鍵問題也尚未完全清楚，距離成功研發QS抑制劑并將其廣泛應用于臨床仍有很長的路要走。

4 降低細菌的運動與黏附能力

進入宿主體內后，細菌首先須借助自身的運動與黏附能力定植于特定的組織/細胞表面，為后續的感染和增殖提供條件。幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的鞭毛結構須由FlaA和FlaB蛋白在九碳糖pseudaminic acid（Pse）的O-連接糖基化修飾作用下才能夠正常組裝并發揮運動功能，而Pse的生物合成先后需要 PseB、PseC、PseH、PseG、PseI和 PseF的參與才能完成[27]。Menard等通過高通量篩選與計算機模擬相結合的方式對Pse合成抑制劑進行篩選，發現CD24868、CD26839和CD36508等3種小分子物質對于Pse的合成具有劑量依賴性的抑制作用，從而有望降低細菌的生存能力，及時被宿主的免疫系統清除[28]。

在革蘭陽性菌中，部分細菌黏附因子在錨定于細菌表面肽聚糖層的過程中須借助于分選酶A（sortase A，SrtA）的轉肽酶活性，干擾SrtA活性可顯著降低細菌感染能力，使得SrtA成為一種極具潛力的新型藥物作用靶點[29]。槲皮苷（quercitrin，QEN）是一種來自香柏等中草藥的生物類黃酮化合物，具有抗炎作用，早期研究發現其對系統性紅斑狼瘡、動脈粥樣硬化等具有一定療效[30-31]，Liu等發現QEN在體外實驗條件下可以有效抑制金黃色葡萄球菌SrtA重組蛋白的活性，細菌在QEN的作用下對于纖維蛋白原和纖連蛋白的黏附作用大幅下降[32]。不僅如此，QEN還能通過影響細菌唾液酸代謝途徑，降低肺炎鏈球菌的生物膜形成能力，其在體內實驗中的效果仍有待證實[32]。

5 干擾細菌毒素的生成與釋放

細菌毒力因子（virulence factors，VF）的生成/釋放效率與感染類疾病發生的嚴重程度密切相關，應用VF抑制劑不僅能夠精準降低細菌致病能力、提高患者生生存率，并且由于該類藥物不直接抑制細菌生長、細菌生存壓力小，因此更不易于誘導細菌耐藥性的產生，是一種較為理想的輔助抗菌手段（http://www.mgc.ac.cn/VFs/）[33]。

Clp蛋白酶家族廣泛參與金黃色葡萄球菌毒力基因表達、細胞壁合成、細胞分裂等過程，是控制金黃色葡萄球菌VF表達水平的重要影響因素。Gao等通過gfp-luxABCDE雙報告質粒和金黃色葡萄球菌毒力相關基因的多重啟動子報告平臺篩選毒力蛋白小分子抑制物，最終從化學物質文庫中篩選到能夠將高致病金黃色葡萄球菌逆轉為非致病菌株的小分子化合物M21。M21以非競爭方式抑制ClpP活性并間接導致細菌α毒素的表達水平下降，在小鼠感染模型試驗中亦能夠有效減弱受試菌株的毒力，提示該化合物體內抑制活性良好，具有較高的臨床研究價值[34]。

干擾細菌VF的釋放過程同樣具有價值。Ⅲ型分泌系統（type Ⅲ secretion systems，T3SS）由多個蛋白組合而成，其針狀結構能夠將細菌VF注射至宿主細胞內，是大多數革蘭陰性菌發揮其毒性的重要工具[35]。T3SS在革蘭陰性菌中高度保守，研究其抑制劑有助于新型輔助抗菌藥物的研發。目前已知的T3SS抑制物包括8-羥基喹啉衍生物[36]、白藜蘆醇四聚體[37]、2，2′-硫雙（4-甲基苯酚）[38]、柚皮素[39]、甘草黃酮醇[40]等，這些小分子化合物能夠有效抑制T3SS相關基因的轉錄或針尖結構的組裝，但更為深入的作用機制仍有待進一步探討。能夠同時針對T3SS針狀結構蛋白PcrV和胞外脂多糖PsI的雙特異性單克隆抗體MEDI3902可同時降低銅綠假單胞菌的黏附能力和致病性，目前已進入Ⅱ期臨床試驗階段[41]。

6 噬菌體裂解酶

噬菌體是一類對于原核生物具有感染能力的病毒，其在感染末期會通過水解細菌細胞壁的方式破壞細菌結構，以便于成熟噬菌體顆粒的釋放。RNA噬菌體或單鏈DNA噬菌體通過間接干擾宿主菌細胞壁合成的方式導致細菌裂解，而雙鏈DNA噬菌體則直接通過合成一種細胞壁水解酶，即裂解酶或內溶素的方式水解宿主菌的肽聚糖結構。大多數噬菌體裂解酶同時具有N端催化結構域和C端結合結構域的“雙結構域”特點，并根據其催化結構域的作用位點分為胞壁酸酶（作用于β-1，4-糖苷鍵）、肽鏈內切酶（作用于多肽鍵）和酰胺酶（作用于酰胺鍵）等多種類型。

在細菌耐藥愈發嚴重的背景下，噬菌體裂解酶以其獨特的優點而越來越受重視。首先，多項研究表明細菌對于噬菌體裂解酶無法產生抗性，這可能與噬菌體和細菌共同進化，其裂解酶經演化后能夠高效識別細菌特異性位點有關[42-43]。其次，裂解酶相比抗生素具有更好的特異性。廣譜抗生素在殺傷病原菌的同時也破壞了原有的微生態平衡，噬菌體裂解酶的抗菌譜介于抗生素和噬菌體之間，可更好地兼顧抗菌譜與特異性[44]。而且，由于裂解酶直接作用于細菌細胞壁，因此其作用十分迅速，幾秒內即發揮裂解作用，納克級裂解酶即可使細菌濁度出現肉眼可見的下降，Obeso等發現葡萄球菌噬菌體裂解酶LysH5能夠迅速殺死巴氏消毒牛奶中的金黃色葡萄球菌，在4 h內將細菌數量降低至檢測限以下[45]，在體內實驗中也具有較為顯著的效果[46]。最為重要的是，噬菌體裂解酶相較于噬菌體本身而言具有極高的安全性，在使用過程中主要關注由于細菌裂解所釋放的磷壁酸、肽聚糖等促炎性物質所引發的相關并發癥即可[47]。

盡管噬菌體裂解酶仍存在制備和保存條件要求較高、較強的免疫原性、較窄的抗菌譜等缺點，但仍不能改變噬菌體裂解酶作為一種輔助抗菌策略的研究價值和應用前景，運用分子生物學技術在基因水平改造噬菌體，使其能夠攜帶一種或多種高效、廣譜的噬菌體裂解酶，從而更好地為臨床提供服務是今后的研究方向。

7 反義寡核苷酸技術

反義寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotides，AS-ODNs）技術是通過人工合成或構建表達載體制造寡核苷酸片段，從而對目的基因進行抑制、封閉或干擾的一項技術，該技術具有設計簡單、易于合成、特異性極高、不產生免疫反應等優點，在新藥研發等領域的應用前景十分廣闊。目前已應用于原核生物的包括反義RNA（asRNA）、反義DNA（asDNA）和核酶等。其中，反義RNA和DNA分子通過與目的mRNA序列互補結合抑制或封閉目的基因的轉錄和表達；而核酶作為一種具有催化功能的小分子RNA，則能夠特異性識別并剪切目的RNA分子，從而阻斷靶基因的表達。在實驗條件下，反義寡核苷酸能夠有效干擾細菌關鍵基因的表達水平，并因此達到一定的輔助抗菌效果。Jeon等通過抑制空腸彎曲菌外排泵基因CmeABC提高耐藥菌對環丙沙星和紅霉素的敏感性[48]；Meng等則利用反義寡核苷酸技術降低了金黃色葡萄球菌對甲氧西林的耐藥能力[49]。

近幾年，反義寡核苷酸藥物迎來了高速發展期，近3年來由美國FDA批準的各類反義寡核苷酸藥物就多達6種。除輔助細菌感染治療以外，寡核苷酸藥物多用于一些罕見、疑難疾病的治療，有望填補部分疾病治療方案的空白[50]。然而，反義核酸技術在臨床應用中仍面臨藥物遞送效率和體內穩定性兩大技術瓶頸。位于體內環境中的寡核苷酸片段具有穩定性差、易降解、難以進入細胞等缺點，因此常需要對其進行化學修飾以提高穩定性，常見的修飾方式包括硫代磷酸脫氧寡核苷酸（phosphorothioate oligodeoxynucleotide，PS-ODN）、磷酰二胺嗎啉反義寡核苷酸（phosphorodiamidate morpholino oligomers，PMO）和肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）等，這一方面有效增強了寡核苷酸藥物對核酸酶的抵抗能力，增強其穩定性，但也一定程度上導致了藥物親和力的下降、體內炎癥反應等問題[51]。因此在未來幾年內，如何將反義寡核苷酸藥物有效導入細菌并使其在細菌體內穩定發揮抑制作用，從而削弱細菌的耐藥/生存能力，仍是反義技術發展的關鍵方向。

8 結語

抗生素的廣泛應用曾拯救了無數感染患者的生命，是20世紀最偉大的醫學發明之一。然而依據進化論基本原理，其大量使用將不可避免地導致細菌在篩選壓力下進化出相關耐藥特性。伴隨著近年來抗生素濫用情況的加劇、傳統抗生素研發進展進入瓶頸期等問題，臨床多重耐藥細菌比例正逐年上升，可供臨床醫生使用的相關抗菌藥物正逐漸減少，世界正逐步走向“后抗生素時代”。因此，研發新型抗菌藥物以滿足日益急切的臨床需求成為迫在眉睫的重要問題。然而，由于受到目前技術手段的限制，發現一種具有全新作用機制的傳統抗生素難以實現，因此從新思路、新角度入手，通過降低細菌毒性、削弱細菌生存性或干擾耐藥基因表達等輔助抗菌手段降低多重耐藥細菌的治療難度正越來越受到人們的重視。本文對部分具有潛在臨床應用價值的輔助抗菌策略進行了歸納和總結，這些新興抗菌策略雖然目前尚難進入臨床應用，但伴隨著未來技術的發展和進步，將有望成為能夠顯著提高傳統抗生素抗菌效果的新型輔助抗菌手段，為研發新一代抗菌藥物爭取寶貴的時間。