跨膜型抗CD3單鏈抗體介導淋巴細胞體外特異性殺傷AFP陽性肝癌細胞活性觀察

宋月雯，袁向飛，熊夢裳，林芳珍，盧楊，熊冬生，張硯君，范冬梅，張晴

1 中國醫學科學院 北京協和醫學院 血液病醫院 血液學研究所，天津 300020；2 國家兒童醫學中心 首都醫科大學附屬北京兒童醫院 北京市兒科研究所

國內肝癌發病率高且普遍發現較晚，中晚期患者居多。肝癌最主要的根治性手段是肝切除術和肝移植術，但肝源匱缺是世界性難題，很多患者在等待肝源期間病情加重；此外，由于大部分肝癌患者對放化療不敏感，預后差且易復發[1]。腫瘤細胞抗原表達水平較低或表達缺陷時，主要組織相容性抗原(MHC)表達不足，不能被細胞毒性T細胞(CTL)識別并攻擊[2];而表面表達CD3單鏈抗體(CD3scfv)分子的細胞可繞過MHC的限制，直接激活淋巴細胞[3]?；罨牧馨图毎粌H對修飾后的腫瘤細胞起殺傷作用，對于未修飾腫瘤細胞也具有一定的細胞毒作用[4，5]。這提示我們可將CD3scfv分子修飾于免疫原性較弱的腫瘤細胞膜表面，繞過抗原表達及MHC分子限制等抗原局限問題，激活淋巴細胞進而達到治療目的。本實驗室在前期研究中成功構建人AFP啟動子(hAFPp)操控的跨膜型抗CD3單鏈抗體(antiCD3scfv)，并在AFP陽性(AFP+)肝癌細胞中特異性表達[6]。2018年8月～2019年7月，基于以上理論及研究基礎，本文將針對antiCD3scfv分子體外活性進行研究，為肝癌免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 AFP+人肝癌細胞HepG2、Huh-7和AFP陰性(AFP-)正常人肝細胞HL-7702、人乳腺癌細胞MCF-7均購自美國模式培養物集存庫(ATCC)，由本實驗室凍存。正常人外周血單個核細胞(PBMC)分離自正常人富含血小板白膜，經科研用血審批購自天津市血液中心，培養于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基，加入100 U/mL人IL-2刺激細胞生長。所有細胞置于37 ℃ 5% CO2培養箱內常規培養，DMEM培養基、RPMI1640培養基、FBS均購自GIBCO公司。AdCD3scfv及空載AdTrack腺病毒為本實驗室前期構建并鑒定。CytoToX96非放射性細胞毒檢測試劑購自Promega公司，FITC直標抗CD69、抗CD25單克隆抗體購自BD公司，免疫細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ檢測試劑盒均購自eBioscience公司?；罴毎ぷ髡举徸訬ikon公司，倒置顯微鏡購自Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細胞與PBMC結合情況觀察 取對數生長期HepG2細胞，分別感染AdCD3scfv、AdTrack腺病毒(100 MOI)。將感染后的細胞接種至24孔培養板，每種細胞各接種2孔，共4孔。次日，按效靶比10∶1，向上述4孔各加5×105個PBMC(100 μL)；同時各向每種細胞的其中一孔加入可溶性anti-CD3單克隆抗體25 ng/mL，另一孔加等體積PBS。靜置3 h后，移除未結合的游離PBMC。每孔各加入100 μL PBS，于顯微鏡目鏡(40×)下觀察并拍照。

1.2.2 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細胞與PBMC相互作用觀察 采用活細胞工作站動態觀察。取分別感染AdCD3scfv和AdTrack腺病毒的HepG2，接種至24孔培養板。次日，按效靶比10∶1向孔內各加入5×105個PBMC(100 μL)，用水平離心機1 000 r/min離心1 min，使PBMC快速沉于孔底。將24孔板實驗孔及對照孔置于活細胞工作站下，于488 nm通道及白光通道分別辨別靶細胞(GFP標記)及效應T細胞；選取合適的視野，動態觀察效靶細胞的相互作用。

1.2.3 AdCD3scfv介導的淋巴細胞毒性作用觀察 采用細胞介導的細胞毒性試驗(LDH法)。取對數生長期的HepG2、Huh-7、HL-7702和MCF-7細胞,分別以AdCD3scfv(100 MOI)、AdTrack(100 MOI)及PBS感染各種靶細胞48 h。消化收集各組靶細胞，調整細胞密度為1×105/mL，按照分析板設置鋪于相應96孔培養板內。以不同的效靶比，將PBMC細胞懸液加于相應孔內(200 μL/孔)，其中靶細胞最大釋放、靶細胞自發釋放、培養基背景對照、培養基體積對照孔只加100 μL含10% FBS的RPMI1640培養基。按照Promega CytoToX96非放射性細胞毒檢測試劑盒說明書操作，1 h內于490 nm處測吸光度值,計算細胞死亡率。細胞死亡率=(實驗孔-靶細胞自發釋放-效應細胞自發釋放)吸光度值/(靶細胞最大釋放-靶細胞自發釋放)吸光度值×100%。

1.2.4 AdCD3scfv介導的PBMC活化情況觀察 采用流式細胞術檢測共培養體系中PBMC表面活化標志CD69及CD25。細胞類型及感染同1.2.3，感染48 h后鋪96孔培養板，以10∶1加入PBMC(200 μL)共培養24 h。收集PBMC并轉移至流式管，每種靶細胞均分為兩2管；PBS洗2次，加入100 μL PBS重懸細胞。分別加入5 μL FITC直標CD69和FITC直標CD25流式抗體，每管平行設同型對照管，避光室溫孵育30 min。PBS洗3次，孔徑50 μm尼龍網過濾；上流式細胞儀檢測，用FlowJo 7.6軟件分析CD69及CD25陽性T細胞比例。

1.2.5 AdCD3scfv介導的免疫細胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ檢測 采用ELISA法。細胞感染、鋪板同1.2.4；與PBMC共培養24 h后，以250 g離心5 min，收集各孔上清，檢測IL-2、TNF-α、IFN-γ。

2 結果

2.1 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細胞與PBMC結合情況 感染AdCD3scfv的HepG2細胞表面表達antiCD3scfv分子并與PBMC表面CD3分子結合，使PBMC聚集于HepG2細胞周圍；加入可溶性anti-CD3單克隆抗體后，與HepG2細胞膜表面修飾的antiCD3scfv分子競爭，PBMC聚集僅少量減少。加入anti-CD3單克隆抗體前后，感染AdTrack的HepG2細胞均不與PBMC結合。見圖1。

注：souble mAb為可溶性anti-CD3抗體。

圖1 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細胞與PBMC結合情況。

2.2 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細胞與PBMC相互作用 共培養3 h后，PBMC開始向HepG2周圍聚集；共培養6 h后，部分HepG2細胞從視野消失；共培養15 h后，幾乎所有靶細胞都因細胞毒作用漂起或消失。見圖2。

注：綠色熒光為AdCD3scfv修飾的HepG2細胞(靶細胞)，白光為PBMC(效應細胞)。

圖2 AdCD3scfv修飾的HepG2靶細胞與PBMC相互作用

2.3 PBMC對不同靶細胞的殺傷水平比較 與PBMC共培養12 h，感染AdCD3scfv病毒的AFP+細胞死亡率較感染AdTrack、PBS者增加(P均<0.05)；且隨著效靶比增加，死亡率也不斷增強；當效靶比增加至10∶1時，HepG2、Huh-7細胞死亡率分別達到78.59%±7.50%、63.26%±6.21%；感染AdTrack、PBS的各類細胞死亡率均無明顯變化，且PBMC對AFP-細胞的殺傷作用極為有限。見圖3。

注：Blank是指感染病毒時僅加PBS，不加病毒；與感染AdTrack、PBS的同類細胞比較，*P<0.05。

圖3 不同效靶比例下PBMC對不同靶細胞的殺傷作用比較

2.4 效靶細胞共培養體系中PBMC活化表面標志分子CD69及CD25表達比較 PBMC與不同靶細胞以效靶比10∶1共培養24 h，感染AdCD3scfv的AFP+細胞HepG2、Huh-7中CD69、CD25表達增加(P均<0.05)，感染AdTrack、PBS的各類細胞CD69及CD25表達無明顯變化。見圖4。

注：Blank是指感染病毒時僅加PBS，不加病毒；與感染AdTrack、PBS的同類細胞比較，*P<0.05。

圖4 效靶細胞共培養體系中PBMC表面活化標志CD69及CD25的表達水平

2.5 效靶細胞共培養體系中PBMC細胞因子分泌水平比較 PBMC與不同靶細胞以效靶比10∶1共培養24 h，感染AdCD3scfv的AFP+細胞HepG2、Huh-7上清液IL-2、IFN-γ、TNF-α水平增加(P均<0.05)，而感染AdTrack、PBS的各類細胞IL-2、IFN-γ、TNF-α無明顯變化。見圖5。

注：Blank是指感染病毒時僅加PBS，不加病毒；與感染AdTrack、PBS的同類細胞比較，*P<0.05。

圖5 效靶細胞共培養體系中PBMC細胞因子分泌水平比較

3 討論

肝癌是第六位常見的惡性腫瘤，全球范圍內每年新確診病例約85萬人[7]，且有逐年遞增的趨勢。目前，首選治療方案為肝切除術，術后5年生存率可達29%～81%，但復發率仍有51%～69%[8]。肝移植為肝癌根治手段之一，存在肝源缺乏的世界性難題，且其術后復發風險不容忽視。近年來，針對肝癌的分子靶向藥、PD-1抑制劑及其他多種靶向治療研究倍受矚目，但療效都十分有限[9,10]。索拉非尼是FDA惟一批準的用于治療肝癌的分子靶向藥[11]，但患者的預后仍然很差，反應率低于5%，總體生存僅延長約2.5個月[12]。除此之外，尚無確定有效的二線藥物。因此，開發針對肝癌這種惡性腫瘤的新療法具有非常重要的臨床意義，迫切需要尋找到一種有效殺傷肝腫瘤細胞的免疫治療方法。

癌癥免疫治療的核心是腫瘤抗原，近年來利用人體適應性免疫系統，針對腫瘤抗原出現了過繼療法、腫瘤疫苗、抗體藥物等治療手段，但由于諸多因素，免疫治療在實體瘤中未達到理想效果[13]。已有研究表明，當活化的淋巴細胞與靶細胞緊密接觸時，可實現CTL介導的細胞毒作用[4]?？笴D3單克隆抗體(anti-CD3 mAb)可通過Fc段橋聯與Fc受體陽性腫瘤細胞緊密結合，同時激活T細胞，實現裂解靶細胞的功能，但該方法僅適用于Fc受體表達陽性的腫瘤細胞[14]。此外，有學者設計antiCD3scfv使其在腫瘤細胞膜表面穩定表達，可實現CTL對腫瘤細胞的殺傷作用[5，15]。這種免疫細胞的激活是抗體直接作用于T細胞表面CD3分子，并向下游傳遞活化信號的結果。

在前期的研究中，我們成功將antiCD3scfv基因構建于Ad-5腺病毒載體中，并通過hAFPp啟動子限制其只在AFP+肝癌細胞膜表面表達，為治療系統提供靶向性，減少對正常細胞的傷害[6]。接下來為證實antiCD3scfv分子的活性，我們將轉染AdCD3scfv病毒的靶細胞與淋巴細胞共培養。在活細胞工作站觀察到，淋巴細胞在3 h內與靶細胞結合，并在15 h內將視野內靶細胞全部裂解。加入商品化可溶性anti-CD3單克隆抗體后，感染AdCD3scfv的細胞僅有部分PBMC聚集減少。這說明表達于細胞表面的antiCD3scfv分子具有更強的結合能力，可以將靶細胞與PBMC更緊密地連接，使后者活化并發揮細胞毒殺傷作用。隨后，我們用LDH法檢測細胞毒水平，發現淋巴細胞僅對表達antiCD3scfv分子的靶細胞表現殺傷作用，且隨著效靶比升高殺傷作用也越強。在效靶細胞共培養體系中，表達antiCD3scfv分子的AFP+靶細胞能活化效應細胞，且其共培養上清中細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α的分泌水平升高。以上研究結果均表明，antiCD3scfv蛋白具有一定的生物學功能：具有橋連作用，可直接將淋巴細胞與靶細胞緊密接觸；能激活淋巴細胞發揮細胞毒作用，高效殺傷腫瘤細胞；并且，再次證明hAFP啟動子調控antiCD3scfv分子的轉錄，使上述作用具有AFP肝癌特異性。

綜上所述，本研究通過腺病毒實現在肝癌細胞表面修飾antiCD3scfv分子，可繞過表面抗原表達及MHC分子限制等局限問題，直接激活淋巴細胞，為實體瘤的免疫治療提供新思路。