苦參堿對RANKL 誘導破骨細胞分化及TRAF6、c-fos、NFATc1 表達水平的影響

李 欣 李 芳 王 媛 張寶玉 張麗潔

1.首都醫科大學附屬北京潞河醫院內分泌代謝與免疫性疾病中心，北京 101149；2.山西醫科大學第二醫院風濕免疫科，山西太原 030001

類風濕關節炎（RA）具有較高的致殘率，目前尚無有效方法逆轉或修復軟骨與骨的破壞。破骨細胞在維持骨吸收和骨形成的過程中起著重要的作用[1]。NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）是調節破骨細胞生成的關鍵因子，其介導的NF-κB 信號通路對誘導破骨細胞生成、活化，抑制破骨細胞凋亡有著重要的作用[2-3]。研究發現，RANKL 介導的NF-κB 信號通路的激活與腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）、c-fos、活化T 細胞核因子1（NFATc1）等物質有關[4-5]?？鄥A具有免疫抑制作用[6]，其可能與NF-κB 信號通路有關。本研究將通過體外實驗，探索苦參堿對RANKL 誘導破骨細胞分化及c-fos、TRAF6、NFATc1 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

RAW264.7 細胞（湖南豐暉生物科技有限公司，CL0266）培養于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養基（北京索萊寶生物技術有限公司，12100）中，在恒溫培養箱中以5% CO2、37℃及飽和濕度條件下培養。

1.2 分組

根據加入破骨細胞誘導劑RANKL（北京索萊寶生物技術有限公司，P00226-50 μg）及不同劑量苦參堿（北京索萊寶生物技術有限公司，SM8130-20 mg）分為五組，即空白組（A 組）、誘導組（B 組）、苦參堿低劑量組（0.5 mg/mL，C 組）、苦參堿中劑量組（1 mg/mL，D 組）、苦參堿高劑量組（2 mg/mL，E 組）。

1.3 TRAP 染色

RAW264.7 細胞培養24 h 后，3000 r/min，半徑10 cm，離心3 min，棄上清，取細胞懸液300 μL 在6 孔板上爬片，誘導、給藥，7 d 后TRAP 染色（北京索萊寶生物技術有限公司，G1492），顯微鏡觀察多核破骨細胞。

1.4 甲苯胺藍染色

誘導給藥12 d 后，每孔加入1 mL 甲苯胺藍染色液（北京索萊寶生物技術有限公司，G3660）染色，水洗，晾干，顯微鏡觀察骨吸收陷窩。

1.5 qPCR

誘導給藥48 h 及9 d 后分別檢測TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及Calcr、Ctsk mRNA 的表達量。方法：各組中加入1 mL Trizol（北京全式金生物技術有限公司，H10318）提取總RNA，反轉錄為cDNA 后，用Real-time PCR 試劑盒（北京全式金生物技術有限公司，AQ131-01）擴增目的基因，上海晶萊生物技術有限公司合成引物（Calcr F 5′-GAAGTGCCCGCTGATGCCT-3′，R 5′-TGGCTCTCCTGACTTGGTGTT-3′；Ctsk F 5′-CACCCTTAGTCTTCCGCTCA-3′，R 5′-CTTGAACACCCACATCCTGCT-3′；TRAF6 F 5′-CAGCGTGTACGATCGGGTT-3′，R 5′-AAGACCCAAGTTTCCGTGCC-3′；c-fos F 5′-GGCAGAAGGGGCAAAGTAGA-3′，R 5′-GTTGATCTGTCTCCGCTTGG-3′；NFATc1 F 5′-CGTACCTTCCTGCCAATGGT-3′，R 5′-GGGCTATCACGTGGTGTGAA-3′），經95℃5 min 預變性，95℃15 s變性、60℃1 min 退火，共40 個循環，后以95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s，導出熔解曲線，計算Ct 值，GAPDH 為管家基因，用2-ΔΔct法算出Calcr、Ctsk、TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量。

1.6 Western blot

誘導給藥48 h 后，各組中加入蛋白提取液獲得樣品，行SDS-PAGE 凝膠電泳、上樣，轉膜后封閉，TRAF6、c-fos、NFATc1 一抗孵育，清洗，二抗孵育，清洗，ECL 顯色曝光后進行圖像處理，進行TRAF6、cfos、NFATc1 蛋白定量。

1.7 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，進一步兩兩比較采用Tukey 檢驗。以P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRAP 染色

RANKL 誘導后，鏡下可見大量多核破骨細胞，苦參堿干預后，鏡下多核破骨細胞較B 組減少，以D 組、E 組效果為著。見圖1。

圖1 各組甲基綠染色情況（400×）

2.2 Calcr 和Ctsk mRNA 表達量

與A 組比較，B 組Calcr、Ctsk mRNA 表達量明顯增加（P <0.01）。與B 組比較，C、D、E 組Calcr 和Ctsk mRNA 表達量減少（P<0.05）。C、D、E 組Calcr 和Ctsk mRNA 表達量兩兩比較差異有統計學意義（P <0.05），且隨苦參堿濃度增加，Calcr 和Ctsk mRNA 表達量呈逐漸降低趨勢，呈劑量依賴性。見圖2。

2.3 甲苯胺藍染色

B 組骨吸收陷窩較A 組增加。與B 組比較，E 組骨吸收陷窩明顯減少。見圖3。

2.4 TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量

圖2 各組Calcr 和Ctsk mRNA 表達量比較

圖3 各組甲苯胺藍染色（400×）

與A 組比較，B 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表達量明顯升高（P <0.01）。與B 組比較，C、D、E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量明顯下降（P <0.01），且呈劑量依賴性。C、D、E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量兩兩比較差異有統計學意義（P<0.05）。A 組和E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA表達量比較差異無統計學意義（P >0.05）。見圖4。

2.5 TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達

與A 組比較，B 組TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達量明顯增多。與B 組比較，C、D、E 組TRAF6、cfos、NFATc1 蛋白表達量均下降，且呈劑量依賴性。A 組與E 組TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達量比較無明顯差異。見圖5。

圖4 各組TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 表達量比較

3 討論

RA 是一類具有較高致殘率的自身免疫性疾病，骨量減少與骨質破壞是RA 致殘的主要原因。而破骨細胞是人體內唯一具有骨質破壞能力的細胞[1]。近年來破骨細胞活化機制的研究已成為熱點[7]。RANKL 分泌增加則是破骨細胞分化的必要條件[8]。而RANKL介導的NF-κB 信號通路對破骨細胞分化至關重要。RANKL 可與RANK 結合，使其與下游TRAF6 結合，活化NF-κB，促進c-fos 基因表達，c-fos 則可進一步與NFATc1 結合并相互作用，誘導破骨細胞分化[9-10]。

圖5 各組TRAF6、c-fos、NFATc1 蛋白表達

苦參是一種天然中草藥，可用于治療感染、惡性腫瘤等疾病[11]?？鄥A作為其主要成分之一，具有免疫抑制作用[12-13]。研究發現，苦參堿可通過降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等促炎因子減輕關節炎鼠關節腫脹度，降低關節炎指數[14]。此外，苦參堿衍生物M19 也被人證實具有相同的作用[15]。

近年苦參堿對破骨細胞作用機制的研究逐漸增多，發現其可抑制TLR4 和c-Jun 表達，選擇性下調脂多糖誘導體外破骨細胞TNF-α 和IL-1β 的表達[16]。Chen 等[17]發現，苦參堿可降低血清中前炎性因子TRAcp5b、TNF-α 和IL-6 的水平，抑制NF-κB 等多條信號通路，進而抑制破骨細胞分化。同期研究發現，苦參堿可調節Th1、Th2 反應不平衡狀態，考慮可能與NF-κB 信號通路作用于T 細胞有關[18]。

此外，M19 可在體外抑制MAPKs 磷酸化及NFκB 活性，誘導RA-FLS 凋亡，抑制促炎細胞因子及MMP-1、MMP-3、MMP-13 的表達[15]。同時Chen 等[19]發現，核糖體蛋白S5（RPS5）與M19 可協同抑制破骨細胞形成。而苦參堿的另一種衍生物——M54 也可靶向作用于RPS5，抑制破骨細胞生成[20]。研究發現苦參堿可作用于RANKL 介導的NF-κB 信號通路，但對該通路中所涉及的TRAF6、c-fos、NFATc1 相關分子的研究甚少。因此，本實驗初步探究了苦參堿對RANKL誘導破骨細胞分化及TRAF6、c-fos、NFATc1 表達的影響。

本實驗誘導組鏡下可見大量多核破骨細胞、骨吸收陷窩，且Calcr、Ctsk mRNA 表達量較空白組明顯升高，考慮破骨細胞誘導成功。隨苦參堿濃度增加，多核破骨細胞數量、骨吸收陷窩及Calcr、Ctsk mRNA 表達量呈逐漸下降趨勢，且呈劑量依賴性。此結果同Chen等[17]報道結果一致。此外，誘導組中TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及蛋白的表達量最高，提示破骨細胞活化與TRAF6、c-fos、NFATc1 分子有關。而隨苦參堿濃度的增加，TRAF6、c-fos、NFATc1 mRNA 及蛋白的表達量呈逐漸下降趨勢，考慮可能的機制：苦參堿抑制TRAF6 表達，干擾其與RANK 結合，抑制NF-κB活化、c-fos、NFATc1 表達，最終致破骨細胞活化障礙。該結果為苦參堿抑制破骨細胞分化相關機制研究提供了一定的理論基礎，但苦參堿對破骨細胞抑制作用的最佳藥物濃度仍有待進一步驗證。