基于高通量測序技術的紅棗黑斑病病原菌分離與鑒定

劉曉勤 張銳利

摘要：通過探究造成南疆紅棗黑斑病的主要病原菌類別，為該病的靶向防治奠定理論基礎。采用高通量測序技術和傳統分離鑒定相結合的方法分別對南疆的喀什、和田、阿克蘇等3個地區患病紅棗黑斑部位進行病原菌鑒定。結果表明，從27個樣品中獲得91 137個高質量序列，其中相對豐度最高的菌門是子囊菌門，相對豐度最高的菌屬是鏈格孢屬（Alternaria），3個地區鏈格孢屬的相對豐度分別是99.98%、98.15%、99.92%，其他菌屬的相對豐度均在0.95%以下。通過對患病果實樣品和代表菌株進行組織分離、形態學觀察、分子生物學分析和病理學接種試驗，明確造成南疆紅棗黑斑病的主要病原菌是鏈格孢（Alternaria alternata），占85.6%。

關鍵詞：南疆地區;紅棗黑斑病;高通量測序;病原鑒定

中圖分類號： S436.65 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）24-0108-04

紅棗具有豐富的營養和藥用價值，近年來已成為新疆農民增收致富的支柱型產業[1];然而，紅棗黑斑病的發生嚴重阻礙了新疆紅棗產業的可持續發展。該病害于2009年在新疆和田和阿克蘇地區被發現，2011—2016年新疆棗園陸續被感染，發病率高達50%，部分棗園發病率高達70%[2]，給當地經濟造成了嚴重損失，因此對引起紅棗黑斑病病原菌的研究刻不容緩。

目前，對造成紅棗黑斑病病原的鑒定還存在爭議，林忠敏等研究認為，山西省紅棗黑斑病病原菌為交鏈孢屬（Alternaria）和莖點屬（Phoma sp.）[2];靳增軍等報道河北冬棗黑斑病病原物為毀滅莖點霉（Phoma destructiva Plowr.）和鏈格孢（Alternaria alternata）等2種[3];劉曉琳等研究認為，新疆部分地區紅棗黑斑病病原菌為鏈格孢[4]，由此，推測地域不同可能造成紅棗黑斑病病原的不同。

傳統的分離鑒定方法在分析鏈格孢屬形態特征復雜等問題時，準確鑒定菌屬種存在一定困難和局限性[5]。近年來，高通量測序技術因耗時短、效率高、成本低、準確性高和針對性強等特點，廣泛應用于土壤[6]、腸道[7]、葉片和果實[8]等領域。因此，本研究基于高通量測序技術進行預判后，結合傳統鑒別方法[2-4]，有針對性地進行分離鑒定和回接驗證，2種方法取長補短、互為印證，為后續拮抗菌的精準篩選和靶標防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病駿棗果實樣品于2018年11月從南疆的喀什、和田、阿克蘇等3個地區9個患病棗園采集，3個地區的編號分別為喀什地區J1、和田地區J2、阿克蘇地區J3（表1）。

試驗在新疆塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室進行。供試棗果為農一師十團駿棗成熟期果實，用于致病性測定。培養基有PDA培養基[9]、WA培養基[9]。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取和MiSeq測序 果實DNA的提取使用Fast DNA SPIN Kit for Soil試劑盒（MP），用NanoDrop-2000 測定DNA濃度，然后將質量合格的DNA樣品送上海派森諾生物科技股份有限公司使用 Illumina （MiSeq）平臺對真菌ITS 區進行雙端測序。

1.2.2 數據分析 用DADA2方法進行去引物、質量過濾、去噪、拼接和去嵌合體，得到高質量的序列;用QIIME2 （2019.4）軟件和R軟件中ggplot2對測序結果進行數據分析。

1.2.3 病原物分離與純化 對患病棗果實進行表面清洗消毒后，取患病棗果實病健交界處的果肉，采用組織分離法[10]分離菌株，后在培養基WA上進行純化菌株，將純化的菌株進行編號，置于-80 ℃保存備用。

1.2.4 致病性測定 從棗果黑斑病的分離物中挑選53T-3、50T-2、47T-2、224T-1、224T-7、HP-1、AH-2、3T-3和10T-5等9株代表菌株，通過離體菌塊貼接法測定其致病力。將純化后的菌株接種至PDA培養基在28 ℃條件下培養6 d，用無菌的1 mL移液槍頭從底端打取生長較好的連同培養基一起的菌塊;選取健康無外力損傷的棗果實，用無菌水清洗，后用75%乙醇進行表面消毒，在超凈工作臺中晾干;用無菌牙簽刺孔，將菌餅的菌面朝下接種至棗果實刺孔處，同時用PDA培養基餅塊作對照;將接有有菌菌餅和無菌餅塊的棗果分別放入鋪有濕潤無菌棉的玻璃罐中，每株菌接種3個健康果實，接種完畢后置于28 ℃培養箱中，有光照和無光照12 h交替培養;每24 h觀察記錄果實表面變化情況，待6 d后對患病果肉部分進行菌株再分離。

1.2.5 病原菌鑒定

1.2.5.1 菌株形態觀察 將病原菌的單孢菌株接于PDA培養基，28 ℃恒溫光暗交替培養6 d，記錄其形態特征，參照張天宇的方法[5]在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子梗、喙的形態和成鏈情況。

1.2.5.2 菌株分子鑒定 選取不同地區的9株菌，編號分別為53T-3、50T-2、47T-2、224T-1、224T-7、HP-1、AH-2、3T-3和10T-5;分別在培養基PDA上培養6 d，后用無菌一次性1 mL藍色移液槍頭底端打取菌塊接種在PDA培養基上，28 ℃ 恒溫條件下12 h白晝交替培養7 d后收集菌絲體，用試劑盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）進行基因組DNA提取。以菌株基因組DNA為模板，以Beta-F和Beta-R[11]為引物擴增代表菌株的β-tubulin基因;將PCR產物送生工生物工程（上海）有限公司進行測序，將測序結果在BLAST數據庫中進行比對，獲得同源性較高的菌株序列，通過MEGA6軟件構建系統進化樹，確定菌株親緣關系，明確菌株分類學地位。

2 結果與分析

2.1 物種組成分析

從喀什、和田、阿克蘇等3個地區27個樣品中共獲得91 137個高質量序列，各水平OTUs數量由高到低排列依次為和田地區>阿克蘇地區>喀什地區（圖1）;共檢測出3個菌門分別是子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉菌門（Mortierellomycota），其中子囊菌門（Ascomycota）是物種數量最多的菌門（表1），8個綱、12個目、15個科和19個屬;3個地區相對豐度最高的菌屬是鏈格孢屬（Alternaria），相對豐度分別為喀什地區99.98%、和田地區98.15%、阿克蘇地區99.92%，其他菌屬的相對豐度均在0.95%以下（圖2）;高通量測序結果表明，導致紅棗黑斑病主要病原菌屬為鏈格孢屬。

2.2 病原物的分離結果

通過傳統的組織分離法增加樣品數量，從81份患病果實樣品中分離獲得90株分離物，依據菌落形態初步確定77株鏈格孢菌占85.6%，7株鐮刀菌占7.8%，3株青霉菌占3.3%，3株其他菌占3.3%（表2）;因此，推測導致紅棗黑斑病的主要病原菌是鏈格孢菌。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態學鑒定 將分離獲得的53T-3、50T-2、 47T-2、 224T-1、224T-7、HP-1、AH-3、3T-3、10T-5等9株菌在PDA培養基上28 ℃條件下培養6 d，從圖3-A、3-B可見，菌落顏色初期為白色，后逐漸變為灰色至淡褐色，邊緣整齊;從圖3-C、3-D 可見，分生孢子梗單生或簇生，或直或彎，淡褐色至褐色，（30.0～71.0） μm×（3.9～5.4） μm。分生孢子單生或鏈生，表面光滑，有橫、縱隔膜，倒棍棒形或卵形，淡褐色至褐色，孢身（22.0～40.1） μm×（8.1～13.3） μm。依次對菌株的菌落、分生孢子梗和分生孢子所呈現出來的顏色變化、形態特征等參照文獻[5]進行鑒定，初步鑒定其為鏈格孢（Alternaria alternate）。

2.3.2 分子生物學鑒定 通過傳統組織分離后進行PCR擴增獲得β-tubulin基因，后在數據庫中進行比對構建系統發育樹（圖4），所有供試菌株與A.alternate聚在同一個單源分支上，同源性為99%。UPGMA聚類分析結果表明，3個地區的樣品聚類在一起（圖5）。圖4、圖5均表明導致南疆3個地區紅棗黑斑病的主要病原菌是A.alternate。

2.4 致病性測定

將分離獲得的代表菌株回接至健康的駿棗果實上，棗果在接種病原菌20 d后，接種部位開始形成病斑，呈黑色，病斑逐漸擴大（圖6-B），接種病癥與田間癥狀相同（圖6-C），致病性測定結果表明，導致紅棗黑斑病的主要病原菌是A.alternate。

3 討論

目前，關于造成紅棗黑斑病病原的研究報道較多;但可能因地域或品種不同，不同學者的研究結果各有不同。王軍等鑒定了山東省部分縣（市）冬棗黑斑病病原為細鏈格孢菌[A.alternata（Fr.） Keissler][12];宗淑萍等發現河北省冬棗黑點病病原菌為桑殼小圓孢菌（Coniothyrium Sacc.）、仁果莖點霉（Phoma pomirum Thum）以及細鏈格孢[A.alternata（Fr.） Keissler][13];包慧芳等研究認為，新疆部分地區紅棗黑斑病病原為鏈格孢（A.alternata）[14]。本研究結果表明，針對南疆地區紅棗黑斑病的病原研究很有必要。

因鏈格孢屬種類多、形態特征復雜多變，傳統的分離鑒定手段一部分主要依靠肉眼判斷，主觀性較強，一些細微差異可能被忽視，準確率降低。隨著研究對象范圍的擴大和數量的增加，傳統的分離鑒定存在耗時長、效率低、成本高等局限性，在一定程度上影響了后續試驗的深入開展，而高通量測序技術的應用[6-8]可彌補傳統分離鑒定的不足，也為導致紅棗縮果病等其他病害病原的準確鑒定和靶向防治提供思路。當然要想達到高效防治，還須對病原菌的生活習性、侵染時機以及發病條件等方面進行深入系統的研究。

本研究采用高通量測序技術和傳統分離鑒定相結合的方式，對南疆喀什、和田、阿克蘇等3大紅棗產區患病棗園中患病駿棗進行樣品采集，通過對病原物進行組織分離、形態學觀察、病理學接種試驗和分子生物學分析，結果表明，鏈格孢（A.alternata）為主要的病原菌，試驗結果與向征等的研究結果[15-16]一致。

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