番木瓜干旱脅迫相關CpDHN基因的克隆與原核表達

郭靜遠 鄒智 孔華 郭運玲 郭安平

摘? 要：本研究基于轉錄組獲得的CpDHN轉錄本序列，以番木瓜‘臺農二號組培苗葉片為材料，采用RT-PCR技術克隆了該基因包含完整ORF在內的425 bp cDNA序列。序列分析表明，CpDHN預測編碼93個氨基酸，其理論分子量為10.50 kDa、等電點為6.62、總平均疏水指數為?1.984、核定位。除保守的K片段外，蛋白還含有1個S片段，可歸為KS型脫水素。在擬南芥中的10個脫水素中，CpDHN與AtLEA8的親緣關系最近，相似性為53.3%。值得注意的是，雖然CpDHN的編碼區不存在內含子，但其3UTR含有1個與AtLEA8類似的內含子。表達譜分析顯示，該基因在根和葉片中均受干旱脅迫誘導。此外，還構建了CpDHN的原核表達載體，SDS-PAGE分析顯示，該蛋白在大腸桿菌中可高效表達。這些結果為下一步的功能鑒定奠定了堅實的基礎。

關鍵詞：番木瓜;脫水素;基因克隆;表達分析;原核表達

中圖分類號：S59;S813.3? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： Based on de novo assembled transcript sequences， a 425-bp cDNA of CpDHN， which includes the complete coding sequence， was isolated from the leaf tissue of papaya （Carica papaya L.） cultivar Tainong No.2 by using RT-PCR. Sequence analysis revealed CpDHN putatively encodes 93 amino acids， which was predicted to target the nuclear， harboring a theoretical molecular weight of 10.50 kDa， an isoelectric point value of 6.62， and a GRAVY value of ?1.984. CpDHN belongs to the KS-type dehydrin， which includes one conserved K-segment as well as one S-segment. Among ten family members present in Arabidopsis， CpDHN exhibits the highest sequence similarity of 53.3% with AtLEA8. Similar to AtLEA8， CpDHN contains no intron in the coding region but harbor one in the 3UTR. Transcriptional profiling revealed that this gene was significantly regulated by drought stress in two of three tissues examined in this study， i.e.， root and leaf. Moreover， the prokaryotic expression vector of CpDHN was also successfully constructed， and SDS-PAGE showed that the protein could accumulate at considerably high level in Escherichia coli. Results obtained from this study provide a basis for further functional analysis.

Keywords： papaya （Carica papaya L.）; dehydrin; gene clone; expression analysis; prokaryotic expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.006

脫水素（dehydrin），又名第二類胚胎發育晚期豐富蛋白（late embryogenesis abundant protein， LEA）[1]，是一類廣泛存在于種子植物、苔蘚、藻類、酵母和藍細菌等中的親水型蛋白，在低溫、干旱、高鹽等非生物逆境脅迫下可維持植物細胞的正常代謝以及細胞膜結構的穩定性[2]。脫水素的分子量在9～200 kDa不等[3]，結構上常包含3類保守的基序，即K、S和Y片段，K片段是一個高度保守的富含Lys的基序，存在于所有家族成員中;S片段主要由絲氨酸殘基組成，包含磷酸化位點，與蛋白的核定位有關;Y片段位于N端，存在于部分家族成員中，但其功能目前還不是很清楚。根據這3類基序的存在與分布順序，脫水素可以分為YnSK2、Kn、SKn、KnS和Y2Kn等5種類型[4]。

番木瓜（Carica papaya L.），隸屬于雙子葉植物綱番木瓜科番木瓜屬（Carica），與模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）同屬十字花目。番木瓜原產于美洲南部和中部，目前廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區。在我國，番木瓜主要分布于華南地區如海南、廣東、廣西和福建等?。▍^），此外，在云南和四川也有少量種植。作為典型的熱帶作物，番木瓜可全年開花和持續結果，在我國種植區易受低溫和干旱脅迫的影響[5-6]，嚴重影響產量和品質。因此，開展番木瓜抗逆生物學研究具有重要的理論意義和應用價值。

本研究重點報道一個干旱脅迫相關的CpDHN基因，包括其基因結構、序列特征、表達特性以及原核表達情況，以期為進一步的功能鑒定奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試材料為‘臺農二號番木瓜組培苗。番木瓜的基因組數據下載于Phytozome v12（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），轉錄組數據下載于NCBI SRA數據庫（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/sra/）。

1.2? 方法

1.2.1? 總RNA提取和cDNA合成? 取番木瓜組培苗葉片50 mg，參照RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（天根生物公司）說明書提取總RNA，然后采用DNase I酶（Promega公司）清除RNA樣本中可能殘留的DNA。雙鏈cDNA的合成參照TaKaRa公司Prime ScriptTMRT reagent Kit進行。

1.2.2? 番木瓜CpDHN基因的克隆? CpDHN的轉錄本來源于本研究團隊從頭（de novo）組裝的轉錄組，為實驗克隆該基因，在基因的5和3UTR設計引物對（CpDHNF： 5-ATTGATCTTCGTTCGGAGTTT-3和CpDHNR： 5-ATCCCACAAGGAAGGAAACAG-3），參照文獻[7]中的方法進行第1輪PCR，PCR產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。為將目標片段克隆到pET-32a（+）載體，同時在開放讀碼框（ORF）的兩側設計引物對（CpDHNHF： 5-ACCGACGACGACGACAAGATGGCTGAACACCACGAGAGC-3和CpDHNHR： 5-GCAGCCGGATCTCAGTGGTTAATCTGACGTCTCTTTCTT-3），該引物的兩側包含可以與pET-32a（+）載體進行同源重組的同源臂。通過以第1輪PCR產物作為模板，進行第2輪PCR，其反應體系和反應程序與第1輪PCR一致。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的條帶進行切膠回收。

用BamHⅠ和NcoⅠ對pET-32a（+）質粒進行酶切（37 ℃，12 h），酶切產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶。然后，參照諾唯贊公司ClonExpress II One Step Cloning Kit （C112-02）試劑盒說明書，將線性化載體和第2輪PCR膠回收產物按比例混合，在ExnaseⅡ催化下，37 ℃、30 min，完成兩線性化DNA的體外環化，構建pET-32a（+）-CpDHN原核表達載體。將重組產物轉化大腸桿菌菌株DH5α，挑取菌落PCR正確的單克隆進行測序確認，然后選取測序結果正確的單菌落進行擴大培養并提取質粒備用。

1.2.3? CpDHN的序列分析? 利用序列處理在線工具包（SMS）（http：//www.bio-soft.net/sms/）對ORF進行分析并翻譯成蛋白質，利用（http：//web. expasy.org/protparam/）對CpDHN編碼蛋白的理化性質進行分析預測，利用Protscale（http：//cn. expasy.org/tools/protscale.html）分析親水性/疏水性，利用TMHMM軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/TMHMM/）預測蛋白的跨膜結構，利用（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/）進行二級結構的預測，利用MEGA6.0軟件將CpDHN蛋白與已報道的部分脫水素進行多序列比對并構建進化樹。

1.2.4? 基因的表達特性分析? 參照文獻[7]的方法，利用轉錄組數據（SAMN09096786）[8]分析基因在根、葉片和韌皮部樹液中的表達模式及其對干旱脅迫的響應模式：植株為3月齡的種子苗，以正常澆水的作為對照，斷水10 d和20 d分別定義為輕度和重度干旱脅迫，每個處理設置2次生物學重復。

1.2.5? CpDHN基因在大腸桿菌E. coli BL21中的表達? 將重組質粒pET-32a（+）-CpDHN和對照質粒pET-32a（+）分別轉化大腸桿菌菌株BL21，分別命名為BL-CpDHN和BL-pET32a。挑取菌落PCR正確的單克隆于含卡那霉素（50 mg/L）的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，次日按1%體積比接種，37 ℃、200 r/min培養至OD=0.6，經IPTG（終濃度0.8 mmol/L，37 ℃，200 r/min）誘導4 h后，細胞裂解后離心，取上清進行SDS- PAGE分析。

2? 結果與分析

2.1? 番木瓜CpDHN基因克隆

在前期的研究中，本研究團隊采用從頭組裝的方法構建了番木瓜不同組織的轉錄組文庫。搜索該文庫發現存在2條長度分別為1309 bp和750 bp的轉錄本，二者的ORF均為282 bp，其差別在于前者的3UTR可能存在1個559 bp的內含子。為證實該結果，將這2條轉錄本比對到番木瓜的基因組，發現它們確實屬于同一基因座（命名為CpDHN）的2種可變剪接形式，基因的編碼區無內含子，而3UTR存在1個內含子（圖1A），該內含子在長的轉錄本中被保留了下來。為進一步證實該基因的轉錄模式，進一步搜索了NCBI中番木瓜的表達序列標簽（EST）數據庫，在獲得的59條EST中，絕大多數支持3UTR內含子的存在，而另外3條則支持該內含子存在滯留，這與轉錄組數據結果是一致的（圖1B）。

隨后，以番木瓜葉片組織反轉錄的cDNA為模板，以CpDHNF/R為引物對該基因進行實驗克隆。首輪PCR成功擴增到一條近500 bp的特異條帶（圖2A）。然后，研究以第1輪PCR產物作為模板、以CpDHNHF/R作為引物進行第2輪PCR，成功擴增到約300 bp的特異條帶（圖2B）。目標片段切膠回收后采用同源重組的方法克隆到pET-32a（+），篩選單克隆進行測序分析。

2.2? CpDHN基因的生物信息學分析

2.2.1? CpDHN基因的序列分析? 測序結果表明，分離到的cDNA與基因和轉錄本的對應區域完全一致。CpDHN預測編碼93個氨基酸（圖2A），蛋白含有1個K片段和1個S片段，屬于KS型脫水素。

2.2.2? CpDHN基因及其編碼蛋白的一級結構? Protparam分析表明，CpDHN的理論分子量為10.50 kDa，等電點為6.62;主要氨基酸組成依次為賴氨酸（20.4%）、組氨酸（19.9%）、谷氨酸（17.2%）和甘氨酸（16.1%）;負電荷氨基酸總數（Asp+Glu）為23，正電荷氨基酸總數（Arg+Lys）為20;不穩定系數為39.07;總平均疏水指數（GRAVY）為?1.984。Protscale分析進一步證實CpDHN主要表現為疏水性（圖3A）。這表明CpDHN是一個高度親水的穩定蛋白。

2.2.3? 蛋白的亞細胞定位和跨膜結構域分析? Wolf PSORT分析表明，CpDHN蛋白主要定位在細胞核。TMHMM分析表明該蛋白無跨膜結構（圖3B）。

2.2.4? 蛋白的二級結構預測? 通過在線軟件http：//npsa-pbil.ibcp.fr/對CpDHN蛋白進行二級結構預測，結果表明，CpDHN的二級結構主要以α-螺旋（圖3C中藍色豎線）為主，占整個氨基酸序列的36.56%，8.6%為β-轉角（圖3C中綠色豎線），3.23%為伸展鏈（圖3C中紅色豎線），其他為無規則卷曲（圖3C）。

2.2.5? 多序列比對與進化分析? 將CpDHN編碼的氨基酸序列與已報道的10個擬南芥脫水素基因[13]推導的氨基酸序列進行多序列比對，同源分析表明，CpDHN與AtLEA8（AT1G54410.1）序列相似性最高，為53.3%，而與其余9個脫水素的相似性介于13.5%～19.2%之間（圖4）。進一步的進化分析表明，CpDHN與AtLEA8聚在同一支，二者含有序列完全一致的K片段，同屬KS型脫水素（圖5）。

2.3? CpDHN基因的表達特性分析

表達分析顯示，CpDHN在根、葉片和韌皮部樹液中均有表達，其豐度依次為樹液、根和葉片。干旱脅迫處理10 d和20 d后，除樹液外，該基因K片段用陰影標識，S片段用方框標識，Y片段用下劃線標識。

在根和葉片中的表達水平均隨處理時間的延長而逐步上升，干旱處理10 d后，該基因在葉片中存在2.3倍的上調表達;干旱處理20 d后，該基因在根和葉片中分別存在2.1倍和3.7倍的上調表達（圖6）。

2.4? CpDHN在原核細胞中的表達

為探討CpDHN能否在原核細胞中進行高效表達，將重組質粒pET-32a（+）-CpDHN和對照質粒pET-32a（+）分別轉化大腸桿菌BL21，取1%過夜培養的菌液在37 ℃、200 r/min條件下培養至OD=0.6后，用0.8 mmol/L IPTG誘導4 h，取裂解上清進行SDS-PAGE分析。結果顯示，在對照BL-pET32a細胞的上清中檢測到1條約20 kDa的特異性條帶（TrxA-intein融合蛋白的理論分子量為20.4 kDa），而在BL-CpDHN的細胞上清中檢測到1條約30 kDa的特異條帶（TrxA-CpDHN融合蛋白的理論分子量為28.07 kDa）（圖7），這表明，CpDHN可在原核細胞中高效表達，且為可溶性蛋白。

3? 討論

植物的自然生長環境是由一系列復雜的非生物脅迫和生物脅迫組成的。隨著全球水資源短缺、土地鹽漬化加劇以及荒漠化土地面積的增加，非生物脅迫已經成為影響植物分布和生長發育的重要限制因子[9]。據不完全統計，全球只有不到10%的耕地免受嚴重非生物脅迫的影響[10]，而受到干旱影響的耕地高達45%[11]。因此，積極篩選和鑒定相關的抗性基因變得刻不容緩。

脫水素是植物生長發育過程中的關鍵蛋白，在提高植物對非生物脅迫的抗性方面發揮著重要作用。研究表明，棉花脫水素基因GhDHN03和GhDHN04被敲除后，其滲透脅迫和鹽脅迫的耐受能力顯著降低[12];沙冬青脫水素基因AmDHN132在擬南芥中的過表達改善了擬南芥的耐鹽性、滲透性和耐寒性[13];辣椒脫水素基因CaDHN4在擬南芥中過表達可提高轉基因植株對低溫和鹽脅迫的耐受能力[14]。然而，至今尚無有關番木瓜脫水素的報道。

本研究首次報道了番木瓜脫水素基因CpDHN，該基因的編碼區不存在內含子，預測編碼93個氨基酸，屬于穩定的（不穩定系數<40）、高度親水（GRAVY

根據蛋白中K、S和Y等3類保守基序的存在模式，擬南芥的10個脫水素分為5種類型，即SKn（AtLEA4、AtLEA5、AtLE10、AtLEA34和AtLEA44）、Kn（AtLEA33）、YnSK2（AtLEA51和AtLEA14）、Y2Kn（AtLEA45）和KnS（AtLEA8）[4]。CpDHN包含1個K片段和1個S片段，與AtLEA8同屬KS型脫水素，其K片段序列與AtLEA8的K片段序列完全一致，為HKEGIVDKIKDKIHG，這有別于大部分脫水素K片段序列組成（EKKGIMDKIKEKLPG）。K片段存在于所有脫水素中，能形成脫水素的重要功能結構——雙親性α-螺旋[20]，α-螺旋橫向插入膜中通過與膜脂結合，對生物膜和蛋白質的結構起到穩定作用，從而阻止細胞內水分的過多流失[19]。不同脫水素的K片段序列存在一些單氨基酸替換和結構修飾，其他研究中報道過同樣的情況，Allagulova等[21]對花旗松脫水素cDNA片段的測序和相應氨基酸序列分析結果表明，其K片段由以下氨基酸組成（Q/E）K（P/A）G（M/L）LDKIK（A/Q）（K/M）（I/L）PG。除AtLEA33和AtLEA45外，其他脫水素均含有S片段，S片段主要由絲氨酸殘基組成，研究表明S片段的磷酸化有助于脫水素在信號肽的引導下進入細胞核[22]。此外，AtLEA14、AtLEA45和AtLEA51中還含有Y片段，其確切功能還有待深入研究。

研究進一步表明CpDHN在根、葉和樹液中均有表達，且在前2種組織中均受干旱脅迫誘導。事實上，其他物種中的研究結果表明脫水素基因廣泛受低溫、干旱、高鹽等非生物逆境脅迫誘導[23]。此外，本研究還成功構建了CpDHN的原核表達載體，并證實其蛋白可在大腸桿菌中高水平積累，這為在原核生物和植物體內中進一步研究其生物學功能奠定了堅實的基礎。

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