光質對紅茶萎凋葉蛋白酶和淀粉酶活性及相關成分的影響

羅紅玉，王 奕，楊 娟，袁林穎，翟秀明，唐 敏，王 杰，黃尚俊，鐘應富*

(1. 重慶市農業科學院茶葉研究所，重慶 永川 402160；2. 重慶市茶葉工程技術研究中心，重慶 永川 402160；3. 國家茶葉產業技術體系重慶綜合試驗站，重慶 永川 402160)

【研究意義】萎凋是紅茶加工的第一道也是最關鍵的工序，即是將采回的茶鮮葉進行薄攤，讓其散失一部分水分的工藝處理過程[1]，同時也是茶鮮葉采后自然衰老的過程。在萎凋過程中，伴隨著系列生理化學變化。萎凋葉品質的好壞直接決定了紅茶品質的優劣?！厩叭搜芯窟M展】有研究表明，光質萎凋可促進氨基酸總量的增加、減少總糖含量[2-3]，顯著提升茶葉香氣、鮮爽度及綜合感官品質[4]。一直以來，普遍認為茶鮮葉在萎凋過程中游離氨基酸和可溶性糖含量的上升來源于蛋白質、淀粉的水解[5-7]。研究者在白茶萎凋過程中，發現大部分參與氨基酸和蛋白質合成的蛋白發生顯著下調，而大部分參與蛋白質水解的蛋白發生顯著上調，表明蛋白質水解是游離氨基酸含量升高的主要原因[8]。目前，茶葉中蛋白、蛋白酶及淀粉、淀粉酶的研究只見少量報道，研究表明人工光照萎凋可提前使萎凋葉中的蛋白酶活性達高峰，且高于室內自然萎凋[9]，曬青和做青利于蛋白酶、淀粉酶的活化，做青可降低淀粉含量，利于氨基酸、可溶性蛋白及可溶性糖的積累[10-11]。在茶葉中，蛋白質含量豐富，約占干重的20 %～30 %，主要包括谷蛋白(82.05 %)、醇溶蛋白(13.61 %)、白蛋白(3.47 %)和球蛋白(0.87 %)，其中只有1 %～2 %能溶于水，絕大部分不能溶于水而殘留在茶渣中[1, 12]。本項目組前期實驗采用透射電鏡觀察了紅茶萎凋過程中葉片的超微結構，結果發現，鮮葉中的大粒淀粉變成了小粒淀粉甚至消失[13]，還發現，黃光萎凋可提高萎凋葉中氨基酸、可溶性糖含量，藍光萎凋可降低萎凋葉中茶多酚含量，兩種光質能顯著提高紅茶感官品質，所制紅茶外形烏黑較潤、較緊細直，湯色紅、明亮，甜香顯，滋味醇厚，葉底紅亮[14]?！颈狙芯壳腥朦c】對萎凋過程中，不同光質如何通過影響萎凋葉蛋白酶和淀粉酶的活性，從而調節蛋白質、淀粉、氨基酸、可溶性糖含量仍然未知?！緮M解決的關鍵問題】實驗以室內自然萎凋為對照，通過研究黃光、藍光萎凋過程中蛋白酶、淀粉酶及相關成分的變化規律，并探討其相關性，以期為紅茶設施萎凋中光質的篩選提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試原料為2017年9月采摘的福鼎大白(Camelliasinensiscv. ‘Fuding-dabaicha’)一芽二葉鮮葉，采自重慶市農業科學院茶葉研究所實驗茶園 (北緯29°75′，東經105°71′，海拔440 m)。

1.2 實驗儀器

光質萎凋槽：本實驗室自制；6CR-40揉捻機：四川省名山縣山峰茶機廠；6CH-54茶葉烘焙箱：福建安溪興民茶葉機械廠；HB43-S水分測定儀：梅特勒-托利多國際股份有限公司；TU 1901紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗處理

在28 ℃條件下，采用2種不同的LED光源(黃光585 nm、藍光460 nm，光強均為1500 lx)進行萎凋，對照為室內自然萎凋，萎凋時間20 h，萎凋結束時黃光組、藍光組、對照組萎凋葉含水量分別為59.5 %、56.3 %、59.8 %。被照射葉量3.5 kg，攤葉厚度3～5 cm。

萎凋過程中，各萎凋組每4 h取樣10 g測定水分，重復3次；同時取30 g樣置于液氮速凍后保存于-20 ℃，再選擇芽下第2葉用于測定蛋白酶及淀粉酶活性，以及總蛋白和淀粉含量；另取150 g萎凋葉先蒸汽殺青2 min后再80 ℃烘至足干，用于測定萎凋葉游離氨基酸及可溶性糖含量。

1.4 檢測方法

酸性蛋白酶(Acid protease，ACP)、淀粉酶(Amylsse)活性，蛋白質及淀粉含量均采用試劑盒測定，購置于蘇州科銘生物技術有限公司；游離氨基酸測定采用GB/T 8314-2013；可溶性糖測定采用硫酸-蒽酮比色法[15]。

1.5 數據分析

數據采用Excel 2013進行整理繪圖、SPASS 17.0進行方差分析。測定結果以“平均數±標準差”表示，處理間平均值差異顯著性用最小顯著差異法(LSD)比較。

2 結果與分析

2.1 不同光質萎凋葉蛋白酶及淀粉酶的活性變化

萎凋過程中，各萎凋組的蛋白酶活性均呈升-降-升趨勢(圖1)。0～4 h為迅速升高階段，萎凋至4 h，黃光組蛋白酶活性達最高，為1050.21 nmol·min-1·g-1，比茶鮮葉升高了7.4倍，與萎凋結束時相當，顯著高于其余萎凋時段和萎凋組(P<0.5)，其次為對照組，而藍光組升高不顯著(P>0.05)；4～12 h為降低階段，萎凋至8 h，黃光組、對照組迅速降低，藍光組略有降低，萎凋至12 h，黃光組、對照組持續降低，蛋白酶活性與茶鮮葉無顯著差異，藍光組略有升高，此時，各萎凋組蛋白酶活性之間無顯著差異；12～20 h為再次升高階段，黃光組、對照組幾乎呈線性升高，藍光組在16 h處略有降低，隨后顯著升高，萎凋結束時，各組間無顯著差異，其中黃光組最高，為505.75 nmol·min-1·g-1。

圖1 不同光質萎凋過程中萎凋葉蛋白酶活性的變化Fig.1 The change of protease activity in tea leaves during different light withering

萎凋過程中，各萎凋組的總淀粉酶、β-淀粉酶活性變化總體呈升-降-升趨勢(圖2～3)。0～4 h為酶活性迅速升高階段，萎凋第4小時處，對照組的2種酶活性最高，分別為101.00、84.61 mg·min-1·g-1，比茶鮮葉升高了2.1、3.9倍，顯著高于其余萎凋時段和萎凋組，其次為黃光組，2種酶活性較高，分別升高了1.6、3.1倍，而藍光組較低，分別升高了1.1、2.0倍，后兩組的總淀粉酶活性無顯著差異；在4～16 h過程中，2種酶活性有升有降，對照組在第16 h處最低，分別為47.23、40.82 mg·min-1·g-1，黃光組在第16 h處最低，分別為40.41、32.16 mg·min-1·g-1，藍光組在第12 h處最低，分別為46.51、34.51 mg·min-1·g-1；萎凋結束時，對照組的總淀粉酶活性顯著升高，藍光組顯著降低，而黃光組升高不顯著，其酶活性最低，三者間差異顯著，各萎凋組的β-淀粉酶活性升高不顯著，藍光組最高、黃光組最低，處理間差異顯著。

圖2 不同光質萎凋過程中萎凋葉總淀粉酶活性的變化Fig.2 The change of total amylase activity in tea leaves during different light withering

圖3 不同光質萎凋過程中萎凋葉β-淀粉酶活性的變化Fig.3 The change of β-amylase activity in tea leaves during different light withering

萎凋過程中，各萎凋組的α-淀粉酶活性變化趨勢不盡一致(圖4)。對照組在0～8 h期間均無顯著變化，8～16 h期間迅速下降，16 h處最低，為6.41 mg·min-1·g-1，顯著低于其余萎凋時段和萎凋組，萎凋結束時又顯著升高至13.76 mg·min-1·g-1；黃光組在0～8 h期間無顯著變化，隨后持續降低，萎凋結束時最低，為7.43 mg·min-1·g-1，顯著低于0～8 h；藍光組在0～4 h期間迅速升高，4 h處最高，為17.53 mg·min-1·g-1，升高了11.5 %，隨后逐漸降低，萎凋結束時低至10.06 mg·min-1·g-1。

圖4 不同光質萎凋過程中萎凋葉α-淀粉酶活性的變化Fig.4 The change of α-amylase activity in tea leaves during different light withering

2.2 不同光質萎凋葉蛋白酶、淀粉酶相關成分的變化

從表1可知，隨萎凋進程，黃光組蛋白質含量先降后升，藍光組呈降-升-降趨勢，對照組呈緩慢降低趨勢；各組萎凋葉的游離氨基酸含量均呈升-降-升趨勢。

表1 不同光質萎凋過程中萎凋葉氨基酸及蛋白質含量的變化

就蛋白質含量而言，0～4 h為迅速降低階段。第4小時處，降幅由大到小為黃光>藍光>對照，降幅分別為53.7 %、47.5 %、15.9 %，各萎凋組間差異顯著。4～16 h為黃光組持續降低階段，萎凋第12、16小時處，顯著低于其余時段，分別降低了63.9 %、63.7 %；萎凋結束時迅速升高，并與茶鮮葉相當。4～8 h為藍光組持續降低階段，第8小時處最低，降低了48.5 %；12 h處有較大幅度提升，隨后緩慢降低。4～20 h對照組呈緩慢降低趨勢，萎凋結束時最低，降低了22.4 %。

就游離氨基酸含量而言，0～4 h為迅速升高階段。第4小時處，升高幅度由大到小為藍光>對照>黃光，分別升高了42.0 %、38.1 %、27.6 %，前兩者均升至最高，三者間無顯著差異。4～12 h為黃光組持續升高階段，12 h處最高，升高了53.3 %，顯著高于其余萎凋組，16 h處降低，萎凋結束時升高33.7 %，顯著高于其余萎凋組。4～12 h為藍光組持續降低階段，12 h處顯著降低，與茶鮮葉相當，16 h處升高，萎凋結束時無顯著變化。對照組在4～8 h期間維持較高水平，但與后續萎凋時段無顯著差異。

從表2可知，各萎凋組總淀粉含量變化趨勢存在差異，黃光組呈升-降-升趨勢，藍光組逐漸降低，對照組先降后升；對照組可溶性糖含量呈升-降-升趨勢，黃光組和藍光組呈先升后降趨勢。

表2 不同光質萎凋過程中可溶性糖及總淀粉含量的變化

就總淀粉含量而言，黃光組在第4小時顯著升高，顯著高于其余萎凋時段和萎凋組，升高了8.3 %，在8～16 h過程中快速降低，顯著低于其余萎凋時段，萎凋結束時，顯著升高。藍光組在萎凋結束時降至最低，降幅26.0 %。對照組在第12小時處降至最低，顯著低于其余萎凋時段，降幅29.6 %，16～20 h又升高。

就可溶性糖含量而言，黃光組在第4小時達最高，為6.14 %，但與茶鮮葉無顯著差異，8～16 h顯著降低。藍光組、對照組在第12、8小時處達最高，分別升高了15.7 %、12.6 %，顯著高于茶鮮葉。萎凋結束時，藍光組、對照組與鮮葉無顯著差異，而黃光組則較鮮葉減少了11.7 %。

2.3 蛋白酶、淀粉酶活性及成分間的相關性

上述實驗表明，黃光萎凋能在4 h內快速提高蛋白酶活性，并在隨后的萎凋進程中，保持較高水平，能快速降低蛋白質含量，持續提高游離氨基酸含量，還可延緩總淀粉酶、β-淀粉酶活性的降低，迅速提升總淀粉含量。為進一步揭示黃光萎凋對相關物質的影響規律，實驗進一步分析了黃光萎凋過程中，蛋白酶、淀粉酶活性及成分間的相關性。從表3可知，蛋白酶活性與蛋白質含量呈負相關，與游離氨基酸含量呈正相關，但未達顯著水平；蛋白質含量與游離氨基酸含量呈較大負相關，相關系數為-0.586，說明蛋白質的減少對游離氨基酸的積累有較大貢獻?？偟矸勖?、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性均與總淀粉、可溶性糖含量呈正相關，其中，α-淀粉酶活性與可溶性糖含量存在極顯著正相關，系數為0.932；3種淀粉酶活性之間存在正相關，其中，總淀粉酶活性與β-淀粉酶活性存在極顯著正相關，系數為0.989；總淀粉含量與可溶性糖含量存在較大正相關。蛋白酶活性與淀粉酶活性、淀粉、可溶性糖含量間均存在一定正相關，蛋白質含量與淀粉酶活性存在負相關，尤其與總淀粉酶和β-淀粉酶活性存在較大負相關，而與總淀粉以及可溶性糖含量存在正相關，游離氨基酸含量與總淀粉酶和β-淀粉酶活性存在較大正相關，與α-淀粉酶活性、總淀粉和可溶性糖含量存在一定負相關。

表3 萎凋葉蛋白酶、淀粉酶活性與成分間的相關性

3 結論與討論

蛋白酶可將茶葉中的蛋白質水解成各種氨基酸，不僅能改善茶葉的香氣和鮮爽度，而且可減少不溶性復合物產生，提高茶湯質量[16]。淀粉酶是一種重要的水解酶，是水解淀粉和糖原的一類酶的總稱，淀粉酶作用于α-1,4-糖苷鍵，使淀粉水解成葡萄糖、麥芽糖、極限糊精等[17-18]。

實驗發現，在萎凋過程中，各萎凋組的蛋白酶、總淀粉酶和β-淀粉酶活性，以及游離氨基酸含量均呈升-降-升趨勢，黃光組蛋白酶活性高于藍光組與對照組，可溶性糖含量變化規律存在差異；萎凋至4 h，黃光組的蛋白酶活性、對照組的總淀粉酶活性和β-淀粉酶活性、藍光組的α-淀粉酶活性均最高，分別比茶鮮葉升高7.4倍、2.1倍、3.9倍、11.5 %；萎凋至12 h，黃光組的蛋白質含量最低，降低63.9 %，游離氨基酸含量最高，升高53.3 %，對照組總淀粉含量最低，降幅29.6 %，藍光組的可溶性糖含量最高，升高15.7 %。相關性分析表明，黃光組的蛋白酶活性與蛋白質含量呈負相關，與游離氨基酸呈正相關，但未達顯著水平，而蛋白質含量與游離氨基酸含量呈較大負相關，系數為-0.586；α-淀粉酶活性與可溶性糖含量、總淀粉酶活性與β-淀粉酶活性均存極顯著正相關，系數分別為0.932、0.989。結果表明，在所選的光質萎凋條件下，黃光萎凋能顯著提高萎凋葉蛋白酶活性和游離氨基酸含量，降低蛋白質含量；藍光萎凋和室內自然萎凋則可提高萎凋葉淀粉酶活性和可溶性糖含量，降低總淀粉含量。

實驗僅僅檢測了蛋白酶促水解過程中酸性蛋白酶的活性及游離氨基酸含量，而蛋白質除了參與酶促水解外，還存在其他降解途徑，比如胞內蛋白質降解[17]，其他蛋白水解酶如肽鏈內切酶、外切酶等與蛋白質的關系可能更加密切，同時，蛋白質在水解過程中，會產生多肽，最后再生成游離氨基酸。另外，植物葉片中淀粉的水解途徑涉及葡聚糖-水雙激酶、異淀粉酶、磷酸葡聚糖磷酸酶、淀粉酶等多種酶類[19-20]，而本實驗僅僅檢測了淀粉酶類。因此，實驗結果表現出蛋白酶活性與蛋白質含量、游離氨基酸含量之間，總淀粉酶與淀粉、可溶性糖之間均無顯著相關。后續實驗將深入分析萎凋葉中蛋白和淀粉水解的酶類、活性及其在水解過程中的貢獻程度，以明確關鍵的蛋白水解酶和淀粉水解酶，為茶葉萎凋工藝的改善提供更為確切的理論依據。