蕓薹根腫菌分泌蛋白PbSP1的克隆及表達特征分析

余方偉，王神云，張 偉，王 紅，于 利，李建斌

(江蘇省農業科學院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室， 江蘇 南京 210014)

【研究意義】根腫病(clubroot disease)是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)引起的世界性土傳病害，該病原菌的寄主范圍十分廣泛，可危害甘藍、花椰菜、大白菜、小白菜、油菜、薺菜等多種十字花科栽培和野生植物[1]。根腫病常年危害面積約320～400萬hm2，大流行年份發生與危害面積可達900萬hm2，平均產量損失達20 %～30 %，病重田塊直接產量損失達60 %以上[2]。除了直接導致作物減產外，病根中釋放的休眠孢子生命力極強可在土壤中存活達20年[3]，由于目前尚無有效的方法來清除土壤中的休眠孢子，因此在染菌的田塊反復種植十字花科作物將有極大的減產風險?！厩叭搜芯窟M展】細胞學研究發現蕓薹根腫菌的侵染過程主要分為根毛侵染和皮層侵染兩個階段[3-4]：在初侵染階段，初級游動孢子從萌發的休眠孢子中釋放出來后，受到某種寄主化學物質的誘導，吸附到寄主植物根毛表面，然后利用特殊的侵染結構排孢管(Stachel and Rohr)穿透宿主細胞壁，并將變形蟲樣的原生質注入宿主細胞，在宿主細胞內經過多次細胞分裂形成初生原生質團[5]。經過多次十字形細胞核分裂以后，初生原生質團逐漸發育成游動孢子囊。在皮層侵染階段，游動孢子囊釋放出的次生游動孢子侵染根皮層細胞，并發育成次生原生質團。次生原生質團引起寄主細胞的異常增大和分裂，導致植物根部腫大和植株地上部分的萎蔫、矮化、黃化、早衰[6-7]。蕓薹根腫菌在寄主植物內發育形成成熟的休眠孢子，隨腐爛的病殘體進入土壤中，適時再次成為侵染源。相比侵染過程研究，蕓薹根腫菌致病分子機理研究較為滯后?！颈狙芯壳腥朦c】由于蕓薹根腫菌以活體營養的方式寄生在寄主細胞內，目前缺乏有效的遺傳轉化方法，因此傳統的反向遺傳方法研究基因功能也難以在蕓薹根腫菌上應用。越來越多的研究表明病原物的分泌蛋白在其致病過程中起到重要作用，而蕓薹根腫菌分泌蛋白的鑒定僅有少量報道[8-11]?！緮M解決的關鍵問題】為了進一步挖掘鑒定蕓薹根腫菌的潛在分泌蛋白，本研究以湖北長陽火燒坪4號生理小種為實驗材料，采用生物信息學結合異源表達的方法對PbSP1進行了克隆和分析，拓展蕓薹根腫菌分泌蛋白研究，加深對蕓薹根腫菌分泌蛋白的科學認知。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源 根腫病樣采自湖北長陽火燒坪，生理小種為4號，于-20 ℃保存備用。

1.1.2 植物材料 野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana, Col-0)和本氏煙(Nicotianabenthamiana)。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕓薹根腫菌的接種 擬南芥接種方法參考Ludwig-Müller等[9]的報道。病根打成勻漿后，用孔徑25 μm的過濾篩過濾，2500 g，10 min離心2次。將休眠孢子濃度調至約106個孢子/mL，用注射器向14 d苗齡的擬南芥根部周圍注射2 mL上述孢子懸液。將接種后的擬南芥至于23 ℃ ± 1 ℃，16 h光照，8 h黑暗的條件下繼續培養。

1.2.2 蕓薹根腫菌的核酸提取 基因組DNA提?。喝M南芥病根用無菌水洗滌，用吸水紙吸干后置于液氮中充分研磨，用NuClean Plant Genomic DNA kit試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)按照說明書進核酸提取。

RNA提?。喝M南芥病根用無菌水洗滌，用吸水紙吸干后置于液氮中充分研磨，用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)按照說明書進行RNA提取。使用PrimeScript cDNA合成試劑盒(寶生物工程有限公司)按照說明書進行反轉錄合成cDNA，所得產物用作后續載體構建的模板。

1.2.3 生物信息學分析 PbSP1(PBRA_001430)的Genbank登錄號為CEP00376.1，該序列源自Schwelm等[12]報道的蕓薹根腫菌菌株e3的參考基因組。通過SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質結構域分析。使用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)進行信號肽的預測。使用TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進行跨膜結構域的預測。

1.2.4 測序分析 用正向引物5’-TGAGCGTGTTCCACACAGCA-3’和反向引物:5’-TCTGCTTGCCACTACCTACA-3’，以1.2.2獲得的基因組DNA為模板，使用KOD FX Neo(東洋紡)進行擴增。反應體系(50 μl)如下：25 μl 2×buffer, 5 μl dNTPs (2 mM), 1 μl 模板, 各加2 μl上下游引物(10 μM), 0.5 μl KOD FX Neo, 14.5 μl ddH2O。反應條件為95 ℃預變性3 min, 94 ℃ 變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,循環30次后72 ℃反應7 min。PCR產物經過1 % 瓊脂糖膠確認特異性后送測序。

1.2.5 載體構建 構建驗證信號肽的載體方法如下。設計特異引物F1: 5’-ATGAATTCATGCAGA GCTGGCTTGCGCTGT-3’和R1:5’-ATCTCGAGGCCGGAGCACGACCATGCCAGC-3’，以1.2.2獲得的cDNA為模板，使用KOD FX Neo(東洋紡)進行擴增。反應體系(25 μl)如下：12.5 μl 2×buffer, 2.5 μl dNTPs (2 mM), 1 μl cDNA, 各加1 μl上下游引物(10 μM), 0.3 μl KOD FX Neo, 6.7 μl ddH2O。反應條件為 95 ℃預變性3 min, 94 ℃變性30 s,53 ℃退火30 s,72 ℃延伸10 s,循環30次后72 ℃反應5 min。將切膠回收的片段克隆到pSUC2的EcoR I-XhoI位點上，并轉化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送測序，測序正確的克隆進行擴繁，提質粒備用。

構建煙草瞬時表達的載體方法如下：設計引物F2: 5’-ATGGTACC ATGGCTTGTAATTGCACGCTGGATGT-3’和R2: 5’-ATGTCGACGTTCGTACAAGCG CCCAGGTGT -3’反應體系如上所述。反應條件為95 ℃預變性3 min, 94 ℃變性30 s,53 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸40 s,循環30次后72 ℃反應10 min。將切膠回收的片段克隆到pCAMBIA-35s-GFP的KpnI-SalI位點上，并轉化大腸桿菌DH5α，將陽性克隆送測序，測序正確的克隆搖菌提質粒通過凍融法轉化農桿菌GV3101。

1.2.6 酵母蔗糖酶實驗 酵母蔗糖酶實驗方法參照Yu等[11]的報道。將重組質粒pSUC2轉入酵母蔗糖酶缺失菌株YTK12中，轉化后的產物涂布于SD-W培養基上，置于30 ℃培養箱中黑暗培養3～5 d。PBRA_005941預測信號肽與蔗糖酶融合的重組轉化子作為陰性對照(NK)，Avr1b的信號肽與蔗糖酶融合的重組轉化子作為陽性對照。將長出的酵母菌落轉接到CMD-W。將PCR驗證為陽性的酵母菌落轉接到YPRAA培養基上30 ℃培養3～5 d，觀察酵母在YPRAA培養基上的生長狀態。挑取對應的酵母菌落，加入1 mL蔗糖溶液(25 mM蔗糖溶解在0.2 M NaAc，pH 5.0)，然后在37 ℃下孵育30 min。最后加入1 mL 2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC，用4 % NaOH溶液溶解TTC，配置成0.2 % TTC溶液)。在5 min內觀察顏色變化。

1.2.7 煙草瞬時表達 將菌落PCR驗證為陽性的農桿菌克隆加入到含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養液中,至于28 ℃搖床中振蕩培養48 h，5000 r/min離心5 min收集菌體。用10 mM MgCl2重懸5000 r/min離心5 min收集菌體，重復該步驟一次。用侵染緩沖液(10 mM MgCl2，10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH 5.6)重懸菌，稀釋到OD600為0.5，28 ℃黑暗放置2～3 h后用去針頭的1 mL注射器從煙草葉片的背面進行注射，在注射后3～5 d觀察GFP熒光。轉化空載體pCAMBIA-35s-GFP的葉片用作對照。

2 結果與分析

2.1 PbSP1序列分析

為了便于測序，在設計測序引物時往目的基因的上下游各延伸了100 bp，因此目的條帶會比基因本身大200 bp (圖1-a)。剔除掉兩端多余序列后，通過序列比對發現從4號小種中擴增出來的PbSP1的核酸序列與蕓薹根腫菌歐洲菌株e3參考基因組中相應的序列(PBRA_001430)大小相同，都為558 bp，且該基因無內含子(圖1-b)。

seq_1為e3菌株序列，seq_2,seq_3, seq_4為擴增序列，DNA marker從上到下依次為2000、 1000、 750、 500、 250、 100 bp

2.2 PbSP1的信號肽功能分析

用SignalP 4.1和SMART分別對PbSP1的氨基酸序列進行分析(圖2-a)。PbSP1包含185個氨基酸殘基，在其氨基端(1～19 aa)存在1個信號肽,分別在20～57 aa, 58～97 aa,100～140 aa, 146～183 aa處均存在一個Kazal結構域。此外，通過TMHMM v2.0分析未發現PbSP1存在膜定位序列。因PbSP1存在一個氨基端信號肽，推測該蛋白可以被分泌到胞外。通過酵母蔗糖酶分泌實驗發現(圖 2-b)，轉入PbSP1信號肽序列的YTK12能夠在YPRAA上正常生長，也能將TTC還原成紅色不溶物甲臜。上述結果表明PbSP1第1～19位的氨基酸序列(1～19)具有信號肽功能。

圖2 PbSP1信號肽功能驗證Fig.2 Validation of signal peptide of PbSP1 by yeast invertase assay

2.3 PbSP1的表達特征

根據Schwelm等[12]公布的表達量原始數據計算出FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)后，本研究進一步對PbSP1的表達模式進行了分析。如圖3所示，PbSP1在休眠孢子萌發期的表達量最為活躍，在原生質團時期和休眠孢子成熟期表達相對較低，在不同的植物寄主中，PbSP1在油菜中的表達量較高，白菜次之，在甘藍中表達量較低。

G.休眠孢子萌發期，P.原生質團，M.休眠孢子成熟期，Bn.油菜， Bo.甘藍，Br.白菜

2.4 PbSP1的亞細胞定位分析

合適的細胞定位是蛋白發揮正常功能的必要條件。本研究通過煙草瞬時表達進一步明確PbSP1的亞細胞定位。如圖4所示，在煙草的細胞質內有明顯的綠色熒光信號，表明PbSP1分布在細胞質內。

圖4 PbSP1的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of PbSP1

3 討 論

研究表明，分泌蛋白在病原物與寄主互作過程中發揮重要作用[13],因此挖掘鑒定蕓薹根腫菌的分泌蛋白具有重要科學意義。蕓薹根腫菌的遺傳不可操作性極大地阻礙了其分泌蛋白的鑒定。隨著高通量測序技術的飛速發展，許多植物病原體的基因組相繼公布。2015年蕓薹根腫菌e3菌株的基因組公布[12]，給相關基因的克隆和鑒定帶來了便利。本研究通過生物信息學和異源表達技術對蕓薹根腫菌的分泌蛋白PbSP1進行了分析。測序結果表明PbSP1序列與e3菌株相同，且無內含子。本研究發現PbSP1在氨基端存在信號肽，且其他區域不存在跨膜結構域，這些特征與已經報道的其他病原的分泌蛋白相符合，此外PbSP1還存在4個Kazal結構域。在致病疫霉(Phytophthorainfestans)中，含有Kazal結構域的分泌蛋白具有絲氨酸蛋白酶抑制劑的活性，可以抑制寄主的防衛反應[14]。PbSP1在休眠孢子萌發期表達量最高，表明其可能在此階段發揮重要功能。

多數活體營養型病原物缺乏穩定的反向遺傳操作方法，異源表達技術成為研究其基因功能的重要手段。通過酵母和大腸桿菌表達分別揭示了蕓薹根腫菌Pro1的蛋白酶活性[8]，PbBSMT的甲基轉移酶活性[9]，通過煙草瞬時表達揭示PbBSMT的亞細胞定位[10]。本研究也利用了異源表達技術研究了PbSP1的信號肽功能和亞細胞定位。在后續的研究中需要借助異源表達技術來進一步闡明PbSP1及其他分泌蛋白在蕓薹根腫菌致病中的作用。

4 結 論

蕓薹根腫菌PbSP1包含185個氨基酸殘基，在氨基端存在信號肽序列，同時序列中含有Kazal結構域且不含膜定位序列，酵母蔗糖酶實驗表明PbSP1的信號肽具有功能，PbSP1符合分泌蛋白的基本特征。PbSP1在蕓薹根腫菌休眠孢子萌發時期表達最為活躍，在此過程中發揮重要功能。