茉莉酸甲酯結合低溫預貯對尖椒采后品質及生理特性的影響

劉 瑤，鄭秋麗，左進華，高麗樸，劉 婧,2，史君彥，李 淼*，王 清,*

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業農村部蔬菜產后處理重點實驗室，果蔬農產品保鮮與加工北京市重點實驗室，農業農村部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，農業農村部都市農業（北方）重點實驗室，北京 100097；2.安徽農業大學植物保護學院，安徽 合肥 230000）

尖椒（Capsicum frutescensL.）又名辣椒，茄科植物。在我國廣泛種植栽培[1]，不僅感官良好、氣味芬芳[2]，且含有豐富的VC、葉酸、鎂及鉀等營養成分[3]，還具有溫中散寒、開胃消食的功效。但由于尖椒果肉脆嫩，采后代謝極旺盛，所以較易出現失水萎蔫、果皮轉紅、根蒂衰老等現象[4]。因此，研究采后如何妥當貯藏、延長尖椒在貯藏期間的品質具有重要意義。

低溫貯藏廣泛運用在果蔬保鮮中，如水蜜桃、黃瓜、芥蘭、白芹、刺嫩芽、小青菜等[5-7]，但尖椒對低溫敏感，在低溫條件下貯藏極易發生冷害[8]，影響其貨架品質和營養品質，如何調節貯藏期間溫度、保持尖椒在貯藏期間品質尤為重要。低溫預貯（low temperature conditioning，LTC）是將果蔬等產品放在略高于冷害臨界溫度下預貯一段時間，從而減輕后續冷藏期間冷害發生的一種溫度調控方法[9]。其特點是對果蔬無污染、無化學傷害[10]、操作簡便、可對果蔬進行批量處理，因此現今，LTC技術被國內外研究者重視。目前的研究表明，經過LTC技術處理后的獼猴桃、葡萄、石榴、枇杷、茄子等果蔬[11-12]，其冷害發生率降低，商品性升高。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）是植物天然產生的生長調節物質，廣泛存在于植物界中，其特點是在植物的正常生長發育和逆境反應中都起著重要作用[13]。桂連友等[14]將MeJA對植物的誘導效應歸結為以下4 種，分別是：直接防御、間接防御、不防御和負防御。王光[15]使用MeJA浸泡菜心，有效提高了菜心的商品價值和營養品質；劉波等[16]用MeJA處理采后茄子，保持了其貯藏品質；李天等[17]用MeJA處理鮮切芹菜，有效保持了其生理品質。研究表明，MeJA浸泡可延長蔬菜貯藏時間，有效延緩在貯藏期間營養物質損失，延長其貨架期。

雖然現階段已有LTC和MeJA單獨處理采后果蔬的研究和應用，且均表現出較好的貯藏效果，但LTC和MeJA復合處理蔬菜卻鮮有研究，尖椒低溫貯藏和LTC單獨處理雖然可以延長貯藏時間、延緩腐爛，但前者卻會使尖椒發生冷害現象，后者會降低營養物質含量，使其失去商品價值，因此生產上需要多個處理同時應用，以提高蔬菜的貯藏品質。研究MeJA和LTC復合處理在尖椒的貯藏保鮮方面具有實際意義。

本實驗以‘金英達’尖椒為試材，探究4 ℃冷庫貯藏、LTC單獨處理和MeJA結合LTC處理對采后尖椒果實貯藏期間品質及生理特性的變化。通過比較3 種處理下尖椒各項指標，研究復合處理對尖椒采后貯藏的可行性，為尖椒的采后貯藏保鮮技術提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗尖椒品種為‘金英達’，在天安公司小湯山基地采收，采收當天運回實驗室，并挑選無機械傷、無病蟲害、成熟度一致的尖椒為實驗材料。

保鮮膜：0.04 mm聚乙烯（polyethylene，PE）膜，購于北京華盾雪花有限公司。

草酸、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、抗壞血酸，乙二胺四乙酸二鈉、鉬酸銨、三氯乙酸、硫代巴比妥酸 西隴化工有限公司；偏磷酸、愈創木酚 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙醇、丙酮、過氧化氫北京化工廠；TRIzol試劑 美國Invitrogen公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800分光光度計 日本島津公司；D-37520冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；XMTD-6000型數顯恒溫水浴鍋 余姚金電儀表有限公司；DYY-6D型電泳儀 北京市六一儀器廠；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國耶分析儀器股份有限公司；GelDoxXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；LightCycler480II實時熒光定量PCR系統瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理與分組

將挑選好的尖椒隨機分為3 組，分別為A、B、C組。預實驗發現，5 μmol/L MeJA結合LTC處理尖椒的效果最佳，根據此條件，進行如下處理：A組尖椒在常溫下，置于清水中浸泡10 min，晾干后裝入厚度4 mm PE保鮮袋中，折口包裝，于4 ℃貯藏35 d，作為CK組。B組尖椒在常溫下清水中浸泡10 min，晾干后折口裝入PE保鮮袋中，放置10 ℃貯藏2 d后，再轉入4 ℃冷庫中貯藏33 d，作為LTC處理組。C組尖椒在常溫下，置于5 μmol/L MeJA溶液中浸泡10 min，晾干后折口包裝于PE保鮮袋中，10 ℃貯藏2 d后，轉入4 ℃庫中貯藏33 d，作為MeJA結合LTC復合處理組。每7 d（包括第2天）對A、B組和C組尖椒進行觀察、取樣和相關指標的測定。取樣時，取尖椒果實的果肉，將果肉迅速切成小塊放入液氮中冷凍，再將冷凍后的樣品置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，用于生理指標的測定。每個處理隨機取10 個果實，每個處理3 次重復。

1.3.2 冷害指數的測定

尖椒的冷害級數以發生冷害的面積進行評定，具體標準參考表1[18]，尖椒的冷害表現為果面開始出現凹陷斑塊，凹陷部分表皮隨著貯藏時間的延長褪綠、腐爛，呈不規則排列。測定時，取尖椒果實，選10 人建立評分小組進行肉眼觀察，冷害指數按照下式進行計算。

表 1 尖椒冷害級數評定Table 1 Evaluation criterion for chilling injury level of hot pepper

1.3.3 葉綠素含量的測定

葉綠素含量測定采用Deng Yongsheng等[19]的方法，并稍作修改。取尖椒果實組織0.5 g，加入丙酮與乙醇（體積比為2∶1）混合溶液勻漿，于4 ℃、13 000hg離心10 min，取上層清液分別在645 nm和663 nm波長處測定吸光度。

1.3.4 VC含量的測定

VC含量的測定采用鉬酸銨比色法[20]。取尖椒組織1 g，加入5 mL 0.05mol/L草酸-0.2 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）溶液，勻漿，于4 ℃、13 000hg離心20 min，收集2 mL上層清液備用。向收集的2 mL上清液中加入3 mL 0.05 mol/L草酸-0.2 mmol/L EDTA、0.5 mL偏磷酸乙酸溶液（30 g偏磷酸中加入40 mL水，加熱攪拌溶解后過濾，再加入8 mL乙酸、52 mL水）、1 mL體積分數5%硫酸、2 mL 50 g/L鉬酸銨溶液，將混合液搖勻后于80 ℃保溫10 min，冷卻后定容至10 mL，測定其在760 nm波長處的吸光度。

1.3.5 丙二醛含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的測定采用硫代巴比妥酸法[21]。取尖椒果實組織1 g，用5 mL 100 g/L三氯乙酸溶液提取，于4 ℃、13 000hg離心20 min，取2 mL上層清液加入2 mL 6.7 g/L的硫代巴比妥酸溶液煮沸20 min，測定其在450、532 nm和600 nm波長處的吸光度。

1.3.6 相關抗氧化酶活力的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力測定采用愈創木酚法[22]，稱取1 g尖椒組織，用pH 7.8的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）提取，于4 ℃13 000hg離心30 min，取0.1 mL上層清液備用。將1 mL 0.1 mol/L pH 7.8 PBS、0.9 mL 2 mL/L愈創木酚、1 mL體積分數0.3% H2O2溶液和0.1 mL上述上層清液混勻作為反應體系，測定反應體系在470 nm波長處的吸光度。

過氧化氫酶（catalase，CAT）活力測定采用Platt-Aloia等[23]的方法進行測定。稱取1 g尖椒組織，與pH 7.8 PBS在4 ℃ 13 000hg離心30 min，取上層清液。反應體系包括1.9 mL 0.1 mol/L pH 7.8 PBS、1 mL體積分數0.3% H2O2和0.1 mL上述清液，測定在240 nm波長處的吸光度。

抗壞血酸過氧化物酶（aseorbate peroxidase，APX）活力測定采用Wang Qing等[24]的方法。取1 g尖椒組織，加入5 mL pH 7.5 PBS，在4 ℃ 13 000hg離心20 min，取上清液，作為酶提取液。將2.6 mL pH 7.5 PBS、0.3 mL體積分數0.3% H2O2和0.1 mL酶提取液作為反應體系，測定反應體系在290 nm波長處的吸光度。

1.3.7 相關抗氧化酶基因表達的測定

采用實時熒光定量PCR法分析抗氧化酶基因表達，采用TRIzol試劑提取總RNA，操作方法為：取0.1 g尖椒組織加入1 mL TRIzol混勻后，于4 ℃ 12 000hg離心10 min，按說明書要求分別加入0.2 mL氯仿、0.5 mL異丙醇、1 mL體積分數75%乙醇溶液，提取尖椒總RNA。取樣本RNA進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。根據美國國立生物技術信息中心公布的青椒基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，以UBI-3作為內參基因，POD、CAT、APX為目的基因，由上海生物工程有限公司完成引物的合成，引物的設計序列如表2所示。合成的cDNA與目的基因在96 孔板點樣，進行定量PCR，并于LightCycler 480II實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增，每個樣品做3 個重復，反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40 次循環。將實時熒光定量PCR數據用2-ΔΔCt法分析，利用LightCycler 480II實時熒光定量PCR系統軟件進行相對定量的數據分析[25]。

1.4 數據統計與分析

數據整理采用Excel 2010軟件，利用Origin 9.0軟件作圖，利用SPSS 22軟件對數據進行單因素方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒冷害指數的影響

圖 1 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒冷害指數的影響Fig. 1 Effect of MeJA + LTC treatment on chilling injury index of hot pepper fruit

尖椒在低溫條件下貯藏極易發生冷害現象，冷害現象為果蔬在貯藏過程中發生的生理傷害[26]，具體表現為尖椒果實表皮出現水漬狀凹陷，表皮顏色發暗，失去光澤[27]。如圖1所示，尖椒在低溫貯藏期間出現了冷害現象，CK組尖椒在貯藏第7天出現冷害，LTC處理組尖椒在貯藏第21天發生明顯冷害，而MeJA+LTC處理組在貯藏第28天出現冷害，比CK組和LTC處理組出現冷害時間分別延緩了21 d和7 d。在貯藏末期，CK組和LTC處理組尖椒的冷害指數達到77%和51%，而MeJA+LTC處理組尖椒的冷害指數僅為30%，顯著低于CK組和LTC處理組（P＜0.05）。綜上可說明，MeJA+LTC處理可以明顯延緩尖椒在貯藏期間出現冷害的時間，抑制冷害發生進程。

2.2 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒葉綠素含量的影響

尖椒顏色是影響消費者購買的第一指標[28]，隨著貯藏時間的延長，尖椒由綠轉紅[29]，此時尖椒衰老，商品性下降。由圖2所示，在貯藏期間，尖椒的葉綠素含量呈下降趨勢，即在貯藏期間，尖椒逐漸褪綠。CK組尖椒貯藏前期葉綠素含量迅速下降，于第21天降至最低值（0.028 mg/g），21 d后CK組尖椒葉綠素含量保持平緩，貯藏末期葉綠素含量為0.029 mg/g。LTC處理組和MeJA+LTC處理組尖椒在貯藏7 d后，葉綠素含量始終高于CK組，在貯藏第35天，LTC處理組和MeJA+LTC處理組葉綠素含量均達到最低值，分別為0.029 mg/g和0.033 mg/g，且MeJA+LTC處理組葉綠素含量顯著高于CK組和LTC處理組（P＜0.05）。實驗表明，MeJA+LTC處理可延緩尖椒在貯藏期間葉綠素含量的降低，保持尖椒的色澤品質，延長貯藏時間。

圖 2 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒葉綠素含量的影響Fig. 2 Effect of MeJA + LTC treatment on chlorophyll content of hot pepper fruit

2.3 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒VC含量的影響

圖 3 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒VC含量的影響Fig. 3 Effect of MeJA + LTC treatment on vitamin C content of hot pepper fruit

尖椒果實組織中富含VC，其含量可以在一定程度上決定尖椒的貯藏品質，而且VC也可作為尖椒組織內延緩衰老的一種抗氧化劑[2]，因此VC含量可作為尖椒抗衰老的重要指標之一[30]。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，各組尖椒的VC含量均呈現下降趨勢，在貯藏前14 d，CK組和LTC處理的尖椒VC含量迅速下降，分別降低了27.4%和19.7%，而MeJA+LTC處理組的尖椒下降較為緩慢，僅降低了4.3%。在貯藏后期，LYC和MeJA+LTC組的VC含量下降較為緩慢，可能是由于尖椒在低溫貯藏期間進行呼吸作用，減少了自由基的形成，延緩了衰老，從而延緩了尖椒組織內VC含量的下降[31]。在貯藏末期，MeJA+LTC處理的尖椒VC含量顯著高于CK組和LTC處理組（P＜0.05）。因此，MeJA+LTC處理尖椒可延緩其貯藏期間VC含量的降低。

2.4 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒MDA含量的影響

圖 4 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒MDA含量的影響Fig. 4 Effect of MeJA + LTC treatment on MDA content of hot pepper fruit

MDA是植物細胞膜脂過氧化的重要產物之一，其含量的高低可用來評價尖椒組織細胞膜的受損程度和脂質過氧化程度[32]，由圖4所示，在貯藏期間，CK組、LTC處理組和MeJA+LTC處理組的尖椒MDA不斷積累，貯藏第35天，各組尖椒的MDA含量達到最高，CK組和LTC處理組MDA含量分別比MeJA+LTC處理組顯著高32.9%和15.4%（P＜0.05）。說明MeJA+LTC處理可以明顯抑制尖椒在貯藏期間MDA的積累，降低尖椒組織細胞的損傷，延緩采后衰老。

2.5 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒POD活力和POD基因表達量的影響

圖 5 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒POD活力（A）和POD基因表達量（B）的影響Fig. 5 Effect of MeJA + LTC treatment on POD activity (A) and gene expression (B) in hot pepper

POD作為尖椒組織中的保護酶，其可在果實遭受逆境脅迫時調節尖椒果實的代謝，保護其正常的生理活動[33]，同時POD在植物在植物組織中可通過參與反應減輕活性氧自由基對尖椒細胞的損傷[34]。由圖5A可知，在貯藏前期，各組POD活力快速下降，在貯藏前2 d，CK組、LTC處理組和MeJA+LTC處理組的POD活力分別下降了24%、20%和13%。在貯藏第28天，各組POD活力達到極高值，MeJA+LTC處理組的POD活力顯著高于其他兩組（P＜0.05），之后各組POD活力下降，降至貯藏期間的最低值。由圖5B可知，POD基因表達量在尖椒貯藏期間的變化趨勢與POD活力相似，在貯藏第2天，CK組和兩個處理組尖椒的POD基因表達量均較低，之后逐漸升高，并于貯藏第21天升高至極高值，此時MeJA+LTC處理組與CK組和LTC處理組呈現顯著差異（P＜0.05）。貯藏21 d后，尖椒的POD基因表達量迅速下降。結果表明，MeJA+LTC處理可有效延緩POD活力的下降和POD基因表達量的降低，降低尖椒組織細胞的損傷，保持其貯藏品質。

2.6 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒CAT活力和CAT基因表達量的影響

圖 6 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒CAT活力（A）和CAT基因表達量（B）的影響Fig. 6 Effect of MeJA＋LTC treatment on CAT activity (A) and gene expression (B) in hot pepper

CAT在尖椒組織細胞中廣泛存在，其主要作用是把活性氧轉變為低活性物質，從而保護尖椒細胞膜系統[35]，避免植物組織細胞受到逆境傷害。由圖6A可知，尖椒在貯藏期間CAT活力呈現先上升后下降的趨勢，在貯藏前期，CAT活力緩慢上升，并于第7天達到峰值。這可能是由于尖椒在貯藏初期受到了逆境傷害，呼吸作用產生的大量H2O2促進了組織中CAT活力的增強，避免尖椒組織果實受到H2O2的毒害[36]。貯藏7 d后，CK組和兩處理組的CAT活力持續下降，第35天時3 組尖椒的CAT活力降至最低值，CK組和LTC處理組較貯藏0 d時分別降低了53.7%和52.9%，而MeJA+LTC處理組的CAT活力降低了34.5%，且與CK組和LTC處理組差異顯著（P＜0.05）。由圖6B可知，在貯藏期間，尖椒的CAT基因表達量與CAT活力變化趨勢相似，于第2天達到峰值。結果表明，MeJA+LTC處理可以有效延緩采后尖椒CAT活力的降低，延緩尖椒組織的衰老，保持其貯藏品質。

2.7 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒APX活力和APX基因表達量的影響

圖 7 MeJA結合LTC聯合處理對尖椒APX活力（A）和APX基因表達量（B）的影響Fig. 7 Effect of MeJA + LTC treatment on APX activity (A) and gene expression (B) in hot pepper

尖椒組織中的APX是植物組織中防御外界氧化脅迫和其自身活性氧代謝的重要抗氧化酶類[27]，其催化抗壞血酸與H2O2發生氧化還原反應，使其氧化成單脫氫抗壞血酸，同時促使H2O2被分解[37]，降低H2O2對尖椒細胞產生的氧化損傷。由圖7可知，尖椒在貯藏過程中，APX活力呈下降趨勢，且在貯藏14 d后，MeJA+LTC處理組的APX活力始終高于CK組和LTC處理組，在貯藏14～21 d，MeJA+LTC處理組的尖椒APX活力有小幅度上升，之后快速下降。貯藏末期，3 組尖椒的APX活力降至最低值，CK組降至貯藏初始值的35.4%，LTC處理組和MeJA+LTC處理組分別降至初始值的58.8%和70.3%，呈現顯著差異（P＜0.05）。如圖7B所示，貯藏期間，CK組和LTC處理組的APX基因表達量呈逐漸下降趨勢，在貯藏末期達到最低水平，而MeJA+LTC處理組的APX基因表達量在貯藏2～21 d有小幅度上升，21 d后下降，在貯藏末期也達到最低值。APX基因表達量在貯藏期間與其活力呈現相似趨勢，實驗結果表明，MeJA+LTC處理可以有效延緩尖椒貯藏期間APX活力的降低，維持尖椒細胞組織的完整性，保持其貯藏品質。

3 討 論

尖椒在低溫下極易發生冷害現象，發生冷害的尖椒其感官品質和營養品質均會發生下降[7]，采用LTC結合MeJA對采后尖椒進行復合處理，可以有效緩解尖椒冷害現象的發生，保持尖椒貯藏期間的感官品質和商品價值。本實驗將采后的尖椒浸泡于5 μmol/L MeJA溶液中，貯藏期間先置于10 ℃貯藏2 d，再置入4 ℃冷庫中貯藏，貯藏期間，對尖椒的葉綠素含量、VC含量、MDA含量和抗氧化酶活力進行測定。實驗表明，單獨LTC處理的尖椒，貯藏期間其品質和營養成分要優于CK組，這與之前的研究報道結果[4-9]相同。在貯藏期間，MeJA+LTC處理可以有效延緩尖椒葉綠素和VC含量的快速降低，貯藏末期，聯合處理組的葉綠素和VC含量明顯高于CK組，有效延緩了尖椒果實營養物質的流失。同時，MeJA+LTC聯合處理可以有效抑制尖椒組織中MDA的積累，在貯藏末期，CK組和LTC處理組尖椒MDA含量比MeJA+LTC聯合處理組分別高32.9%和15.4%，說明MeJA+LTC聯合處理能有效延緩尖椒果實在貯藏期間的衰老，保持細胞的完整性，與文獻[32]的結論一致。與CK組和LTC處理組相比，MeJA+LTC聯合處理組尖椒的POD、CAT、APX活力保持較高水平，其基因相對表達量與酶活力變化趨勢相似，說明MeJA+LTC處理可以抑制活性氧自由基的產生，與文獻[34]的結論一致，降低細胞過氧化的損傷，有效維持尖椒在貯藏期間的生理品質和營養品質。因此，MeJA+LTC聯合處理采后尖椒可提高尖椒的貯藏品質，運用此種方法處理尖椒具有高效、安全和便捷等特點，不僅僅可以用于尖椒果實的保鮮貯藏，還可推廣至其他蔬果的采后貯藏技術中。