豬瘟病毒化學發光競爭ELISA抗體檢測方法的建立

徐 璐，張乾義，夏應菊，任雪健，李 翠，鄒興啟，徐 嫄，王 兆，趙啟祖，王 琴

(1.中國獸醫藥品監察所 國家/OIE豬瘟參考實驗室，北京 海淀 100081；2.洛陽萊普生信息科技有限公司，河南 洛陽 471000)

豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的嚴重危害養豬業的重大傳染病，是世界動物衛生組織(OIE)規定的必須報告的動物疫病。豬瘟弱毒疫苗的問世，結束了豬瘟疫情肆虐的局面，英國和美國甚至消滅了豬瘟[1-2]。但是在某些國家，豬瘟仍然流行并造成巨大的經濟損失。在我國，豬瘟的大規模暴發已經停止，但仍呈現點狀散發[3-4]。我國實行豬瘟疫苗全面免疫策略防控該病，而進行疫苗抗體水平監測是評價疫苗免疫效果、評估疫病流行情況的主要手段[5]。另外，對于某些不免疫豬瘟疫苗的國家來說，對豬瘟抗體的檢測則是進行豬瘟病毒感染檢測的主要手段[6]。因此，對抗體檢測方法進行不斷優化和升級，進一步增加檢測的準確度、提高檢測效率，對豬瘟防控工作大有裨益。國內外目前有很多針對豬瘟病毒E2蛋白抗體的檢測試劑盒[7-11]，但無論是間接ELISA還是阻斷ELISA，都是采用兩步法的操作過程，檢測時間一般約為3 h，試劑盒在操作便捷性和信號靈敏度等方面并未有明顯的提高。另外，傳統ELISA試劑盒多采用TMB底物，信號的線性范圍窄，無法準確區分抗體效價的高低，大大影響了試劑盒的檢測效果。為了進一步提高試劑盒的敏感性、特異性，同時簡化反應步驟，縮短反應時間，本課題組采用豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體作為競爭抗體，結合化學發光免疫分析技術，建立豬瘟病毒化學發光競爭ELISA抗體檢測方法(簡稱：化學發光方法)，通過對標準曲線的繪制，實現了檢測結果的相對定量。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬瘟病毒E2蛋白，由本實驗室構建的重組桿狀病毒表達和純化[12-13]；HRP標記豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體，由本實驗室制備；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(簡稱：阻斷試劑盒)，購自美國愛德士公司，批號：FS7083；溯源血清為豬瘟強陽性血清國家參考品和豬瘟陰性血清國家參考品，由中國獸醫藥品監察所提供；質控血清盤共計501份，其中含豬瘟抗體陽性血清248份，豬瘟抗體陰性血清253份，由本實驗室制備和鑒定；交叉反應試驗用血清5份，分別為豬細小病毒(Porcine parvovirus,PPV)陽性血清、豬源牛病毒性腹瀉病病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)陽性血清、豬偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)陽性血清、豬圓環病毒II型病毒(Porcine circovirus virus-II,PCV-II)陽性血清和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV)陽性血清，經金標準方法-熒光抗體病毒中和試驗(Fluorescent antibody virus neutralization test,FAVN)檢驗為豬瘟抗體陰性；比對試驗用血清共計391份，為田間采集的豬瘟疫苗免疫和非免疫豬血清。

1.2 主要儀器和耗材 化學發光儀，購自美國Panomics 公司；聚乙烯發光板，購自Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品的制備和標準曲線的繪制 采用豬瘟血清國家參考品作為溯源血清，用于繪制標準曲線。將豬瘟抗體強陽性血清國家參考品的抗體劑量值賦值為10 000 NCU/mL，并進行系列稀釋，測定稀釋血清的發光值。以抗體劑量值為橫坐標，發光值為縱坐標，運用數據統計軟件進行分析，通過四參數曲線擬合方法擬合繪制標準曲線，從中選擇具有特征的5個濃度繪制標準曲線。

1.3.2 反應條件的優化 由于本方法采用的是競爭原理，因此，反應條件優化時采用豬瘟抗體陰性和陽性血清做2組重復試驗測定發光值(陰性血清發光值的平均值為N，陽性血清發光值的平均值為P)，以N/P的最高比值作為最佳反應條件，進行如下條件優化：(1)抗原的最佳包被濃度和酶標單抗的最佳反應濃度的確定；(2)從1%明膠、1%酪蛋白、5%BSA和10%脫脂乳的PBST溶液中篩選封閉效果最佳的組分；(3)最佳包被條件和封閉條件的確定；(4)室溫條件下，抗原與待檢血清/酶結合物反應以及底物的最佳反應時間的確定。

1.3.3 臨界值的確定 用本方法對質控血清盤進行檢測，同時采用標準品繪制標準曲線，計算每份血清的抗體劑量值。采用SPSS 16.0軟件對所有血清樣本的抗體劑量值進行分析。以敏感性為縱坐標，(1-特異性)為橫坐標，繪制ROC曲線，曲線上的每一個點代表臨界值所對應的敏感性和特異性。計算每個臨界值的Youden指數[Youden指數=敏感性-(1-特異性)]，并以Youden 指數最大的點作為陰、陽性判斷的臨界點，確定該方法的敏感性和特異性。

1.3.4 交叉反應試驗 采用本方法對5份相關豬病毒性傳染病陽性血清進行檢測，判斷是否具有交叉反應。

1.3.5 與商品化試劑盒的比較研究 田間采集的391份血清，分別采用本方法和進口的阻斷試劑盒進行比較，計算兩者的符合率[符合率=(兩種方法檢測結果均陽性數量+兩種方法檢測結果均為陰性數量)/樣本總數×100%]。同時對檢測結果出現差異的血清，采用FAVN方法進行定性檢測。

2 結果

2.1 標準曲線的繪制 通過對標準曲線分析發現，當抗體劑量值>200 NCU/mL時，不同抗體濃度的發光值區分并不明顯。當抗體劑量值在0～200 NCU/mL 時，發光值與抗體劑量值的呈現比較典型的線性關系。在此范圍內，最終選擇10、20、40、100 NCU/mL和200 NCU/mL五個濃度作為繪制標準曲線的標準品(圖1)。

圖1 豬瘟病毒化學發光競爭ELISA抗體檢測方法的標準曲線Fig.1 Standard curve of CLIA competition ELISA method to detect CSFV antibody

2.2 反應條件的優化

2.2.1 抗原包被濃度和酶標單抗最佳濃度 將包被蛋白和酶標單抗分別進行梯度稀釋，結果顯示，當包被抗原進行6 000倍稀釋(終濃度為0.1 μg/mL)、酶標單抗進行4 000倍稀釋時，N/P值最高。因此，確定包被蛋白的最佳包被濃度為0.1 μg/mL(圖2)，酶標單抗的最佳稀釋度為4 000倍(圖3)。

圖2 包被抗原最佳稀釋倍數的確定Fig.2 Determination of the best dilution of multiple coating antigen

圖3 酶標單抗的最佳稀釋倍數的確定Fig.3 Determination of the best dilution multiple of enzyme labeled antibody

2.2.2 封閉液的選擇 通過對不同封閉液組分的比較，結果顯示，含1%酪蛋白的PBST溶液能有效的降低本底值，N/P值最大，故將本方法的封閉液組份確定為含1%酪蛋白的PBST溶液(圖4)。

圖4 封閉液組分的確定Fig.4 Determination for components of blocking solutions

2.2.3 最佳包被條件和封閉條件的確定 試驗證明，包被蛋白在37 ℃環境中包被3 h，包被效果最佳(圖5)；加入封閉液后在37 ℃條件下封閉2 h，N/P值最大，封閉效果最佳(圖6)。

圖5 抗原最佳包被時間的確定Fig.5 Determination of the best coating time

圖6 最佳封閉時間的確定Fig.6 Determination of the best blocking time

2.2.4 抗原與待檢血清/酶結合物和底物最佳反應時間的確定 通過優化試驗證明，抗原與待檢血清/酶結合物在37 ℃條件下作用30 min時，N/P值為最大(圖7)。底物液作用5 min和10 min時，N/P值最大，因此確定5 min為底物最佳作用時間(圖8)。

圖7 抗原與待檢血清/酶結合物最佳反應時間的確定Fig.7 Determination of the best time for antigen and serum/ McAb conjugate reaction

圖8 底物最佳反應時間的確定Fig.8 Determination of the best time for substrate

2.3 臨界值的確定 對501份質控血清進行檢測，陰、陽性血清的抗體劑量值分布在不同的范圍，但個別血清的抗體劑量值存在交叉(圖9)。利用SPSS 16.0軟件對檢測結果進行數據分析，繪制ROC曲線，Youden指數最大值為0.933 472，所對應的抗體劑量值為20.04 NCU/mL。因此，將本方法的臨界值確定為20 NCU/mL，最終將本方法判定標準定為：樣本抗體劑量值≥20 NCU/mL時，為豬瘟抗體陽性；樣本抗體劑量值<20 NCU/mL時，為豬瘟抗體陰性。在此判定標準下，此臨界值對應的敏感性為96.67%，特異性為96.68%(圖10)。

圖9 陰、陽性質控血清樣本的檢測Fig.9 Antibody doses distribution of positive and negative sera

圖10 ROC曲線和臨界值確定Fig.10 ROC curve and cut-off value

2.4 交叉反應試驗 用本方法分別檢測PPV、BVDV、PRV、PCV-II、PRRSV陽性豬血清，所有血清的發光值均<20 NCU/mL，為豬瘟抗體陰性，說明本方法與上述豬常見豬病抗體無交叉反應。

2.5 與阻斷試劑盒的比較 田間采集391份血清，采用本方法和阻斷試劑盒同時進行檢測，2種試劑盒共同檢測出168份陽性和184份陰性，二者的符合率可達90.03%(表1)。

從表1中可以看出，2種試劑盒檢測血清樣本中，共有32份血清的檢測結果是完全不符的，因此將這32份血清采用FAVN方法進行定性檢測。2種方法與FAVN的符合情況見表2和表3。從結果中可以看出，化學發光方法和阻斷試劑盒與FAVN方法的符合率分別為62.5%和37.5%，說明化學發光方法與FAVN的符合率更高。

表1 化學發光方法與阻斷試劑盒符合率Table 1 The coincidence between CLIA method and blocking kit

表2 化學發光方法與FAVN的符合率Table 2 The coincidence between CLIA and FAVN

表3 阻斷試劑盒與FAVN的符合率Table 3 The coincidence between blocking kit and FAVN

3 討論

豬瘟抗體檢測是評價豬瘟疫苗免疫效果的主要指標，是目前豬瘟疫病監測的主要參數之一。本方法通過對單克隆抗體的篩選，選擇了1株具有適宜親和力的單克隆抗體，使其能夠與待檢血清同時加入到反應孔中，與包被蛋白競爭結合，進行一步檢測，大大縮短了檢測時間，降低了檢測強度。而使用范圍最廣的進口試劑盒也采用了E2蛋白和單克隆抗體，但以阻斷原理為主，待檢血清和單克隆抗體需分兩步加入到反應孔中，檢測時間和工作強度均高于本方法。

CLIA是一種集靈敏的化學發光分析和特異的抗原抗體免疫于一體的檢測技術，具有特異性好、敏感性高、分離簡便、快速、無毒無污染和安全穩定等特點[14]。目前該技術已經廣泛用于多種疫病的檢測[15-20]。崔辰等[21]用CLIA建立了檢測豬O型口蹄疫病毒抗體的免疫檢測方法，結果證明，該方法具有較好的特異性和重復性，且靈敏度高于傳統的ELISA方法。但目前該方法尚未用于豬瘟抗體檢測領域，本文建立的豬瘟病毒化學發光競爭ELISA抗體檢測方法填補了這一空白。另外，本方法通過四參數擬合方法繪制出標準曲線，可以將發光值換算為抗體劑量值，不僅使抗體的檢測結果實現相對定量，又能夠避免檢測的系統誤差。因此，本方法適合于豬瘟的田間大規模普查，具有較好的應用前景。