大豆益生元發酵豆乳的制備及其對益生菌數量的影響

雷海容，張楓燃，梁洪祥，李曉東

（1.長春大學科技開發研究中心，吉林長春130022；2.延邊大學，吉林延吉133002）

益生元是指不被人體消化吸收卻可以選擇性促進腸道中益生菌的生長和繁殖，從而改善人體健康的物質[1]。大豆低聚糖（soybean oligosaccharides，SBOS）國家標準[2]中包括蔗糖，但蔗糖并無低聚糖所具有的功效。功能性SBOS 是3 糖構成的棉子糖與4 糖構成的水蘇糖聚合同系物，不被胃酸分解，也不被人體吸收代謝，屬于益生元范疇[3]。功能性SBOS 具有阻止致病菌的定居和繁殖，調節人體腸道菌群平衡；防治腹瀉與便秘的雙向調節功能[4]；降低血壓、防治肝病[5]、增強免疫功能[6]；預防腫瘤并使部分胃癌細胞凋亡[7]等多種保健作用。

益生菌是指對人體健康有益且與人共生的細菌或微生物。干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌同為益生菌，同屬于乳桿菌屬。兩菌株的益生保健功能除均可增強機體免疫系統[8-9]外，干酪乳桿菌具有降血壓、降膽固醇[10]的功效；鼠李糖乳桿菌具有改善宿主腸道健康等功效[11]。

豆乳經益生菌的發酵作用不僅變得美味，還可分解大豆中的抗營養因子，營養成分更趨完善[12]，更易于人體的消化吸收。本研究是以超微粉碎后的脫皮大豆與脫脂牛乳為主要原料，利用功能性SBOS 發酵穩定性的生物學特性，采用干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌混種發酵提純功能性SBOS，制作具有促進增殖腸道益生菌、提高腸道功能、維持腸道健康的保健型發酵豆乳。大豆益生元發酵豆乳除上述保健功效外，還含有脫皮后大豆子葉全部的大豆蛋白質及大豆膳食纖維，制作過程中不除渣、不產生廢水，對環境無污染，具有廣闊的市場應用發展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SBOS（水蘇糖與棉子糖占30%、蔗糖占40%）：長春大學科技開發研究中心；果膠：上海穎心實驗室設備有限公司；蔗糖：南京甘汁園糖業有限公司；干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌：由吉林農業大學獸醫藥理與毒理學實驗室儲藏并提供，兩種菌以1 ∶1 的比例添加；蔗糖標準品、水蘇糖標準品、棉子糖標準品、乙腈（色譜純）：美國Sigma 公司；乳酸細菌培養基（lactic acidbacteria culture，MRS）固體及液體培養基：青島海博生物技術有限公司；脫皮大豆、脫脂牛乳粉：市售；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

FW100 高速多功能粉碎機：浙江省永康市象珠松青五金廠；QYF-100 實驗室用氣流粉碎機：昆山密友實業有限公司；APV-1000 型實驗型高壓均質機：上海順儀實驗設備有限公司；LC-20A 型高效液相色譜儀、RID-10A 型示差折光檢測器：日本島津公司；CSB-SY型超聲波振蕩器：金壇市華城潤華實驗儀器廠；ME204E 型藥物分析天平：METTLER TOLEDO 儀器公司；FA2204B 型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；Mini-15K 微型高速離心機：杭州奧盛儀器有限公司；HZQ-F160（A）C 型高低溫恒溫振蕩培養箱：常州諾基儀器有限公司；SPX 型智能生化培養箱：寧波市江南儀器廠；SJ-CJ-1FDQ 型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；DSX-18L 手提式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療機械廠；AG25 厭氧培養罐（2.5 L）：臨沂正衡化玻儀器有限公司；WP-UP-1820 型實驗室超純水機：四川沃特爾水處理設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配制脫脂乳培養基

將12 g 脫脂牛乳粉加100 mL 純水制成質量濃度12 g/100 mL 的脫脂乳液，盛入三角瓶中，封口后置于滅菌鍋中在115 ℃條件下蒸汽滅菌15 min，迅速冷卻后冷藏備用。

1.3.2 菌株的活化

將干酪乳桿菌及鼠李糖乳桿菌斜面試管從冰箱中取出，置于20 ℃下約15 min，開啟超凈工作臺待用，在無菌條件下挑取菌種于脫脂乳培養基中37 ℃培養24 h，活化培養3 代，獲得活力較好的菌種。

1.3.3 發酵劑的制備

將冰箱中保存的干酪乳桿菌及鼠李糖乳桿菌斜面試管取出，置于20 ℃下約15 min，在無菌條件下挑取少許菌株接種于MRS 固體培養基上，置于厭氧罐中37 ℃厭氧培養至菌落清晰可見，進一步挑取單菌落于MRS 液體培養基中，菌液保存待用。

1.3.4 檢測大豆益生元發酵豆乳發酵期間蔗糖質量

分別稱取5.0 mL 及2.0 mL 樣品于100 mL 容量瓶中，編號后分別加乙酸鋅溶液與亞鐵氰化鉀溶液各5 mL，加水定容至刻度，經超聲波振蕩器振蕩30 min后離心，再經0.45 μm 孔徑的微孔濾膜過濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。采用高效液相色譜系統分離后，經示差折光檢測器檢測進樣液濃度。在一定條件下制作標準曲線，通過與標準曲線比較，計算得出大豆益生元發酵豆乳發酵期間的蔗糖質量[13]。

1.3.5 檢測大豆益生元發酵豆乳發酵期間水蘇糖與棉子糖質量

稱取 2.0 mL 樣品，定容至 100 mL，混勻，經 0.45 μm孔徑的微孔濾膜過濾，所得濾液用于高效液相色譜分析。采用高效液相色譜系統分離后，經示差折光檢測器檢測進樣液濃度。在一定條件下制作標準曲線，通過與標準曲線比較，計算得出大豆益生元發酵豆乳發酵期間的水蘇糖與棉子糖質量[14]。

1.3.6 益生菌數量的檢測

選擇正常對照組、陽性對照組、不同體積的大豆益生元發酵豆乳，共5 組發酵豆乳檢測其益生菌的數量。按制備方法制備發酵豆乳，采用蔗糖接種發酵豆乳作為正常對照組；采用山東產大豆低聚糖沖劑接種發酵豆乳作為陽性對照組，將正常對照組、陽性對照組與大豆益生元發酵豆乳加入MRS 液體培養基中培養48 h，將樣液進行梯度稀釋，分別選擇10-8～10-13的梯度稀釋樣液各0.1 mL 涂布于平板上，37 ℃厭氧培養72 h[15]，檢測各組分發酵豆乳中益生菌數量。每個試驗進行3 次平行試驗，結果取平均值，以CFU/mL 報告測定值。

1.3.7 大豆益生元發酵豆乳的制備方法

1.3.7.1 工藝流程

1.3.7.2 操作要點

1）粉碎

脫皮大豆經多功能粉碎機粗磨后98 %過80 目篩，送入頻率150 Hz 氣流粉碎機內處理，得到直徑約為50 μm[16]的超細粉末過200 目篩。超微粉碎可使大豆膳食纖維結合水力提高1 倍[17]，品質得以改善。

2）高溫煮沸

將過篩后的大豆全子葉豆粉按適當的質量體積比加純水高溫煮沸10 min[18]，期間不斷攪拌，使其分散均勻。高溫煮沸可使膳食纖維顆粒細化，提高水溶性膳食纖維轉化率，降低口感粗糙程度，使苦味與豆腥味消失，增加大豆香味，更重要的是可使大豆中對人體有害的多種抗營養因子鈍化失活，以實現預熟化目的。

3）調和、均質與殺菌

果膠需要全部溶解后，再與脫脂乳粉及冷卻后的豆乳調和后送入均質機中均質2 次，經90 ℃條件下殺菌10 min[19]制成發酵豆乳培養基。均質條件為溫度45 ℃、壓強30 MPa、時間120 s[20]。均質可使豆乳中脂肪與蛋白質粒徑減小，防止脂肪上浮，達到蛋白質與糖的結合，同時也將少量變性蛋白質顆粒進一步細化，并且延緩或防止凝乳形成后乳清大量析出，提高穩定性，獲得良好的質感，可使發酵后的豆乳組織細膩、口感柔和，更易于人體的消化吸收。

4）接種與發酵

將干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌按1 ∶1 比例接種于冷卻后的發酵豆乳培養基，同時加入殺菌后的SBOS 進行發酵。益生元發酵豆乳采用干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌可利用蔗糖發酵[21]的生物學特性，以達到提純功能性SBOS 的目的。由于大豆水蘇糖與棉子糖在高溫、高壓條件下不發生分解現象，因此SBOS 的殺菌條件設定為121℃，壓強30 MPa 處理15 min。發酵期間隨時檢測蔗糖、水蘇糖及棉子糖的質量。發酵豆乳中各組分糖質量與發酵初始時相比：水蘇糖與棉子糖保留率達到86%以上，蔗糖消耗率達到90%以上時，即標志發酵完成。

5）成品

將發酵完成的大豆益生元發酵豆乳放入4 ℃冰箱后熟18 h～24 h，制成成品大豆益生元發酵豆乳。采用MRS 瓊脂平板菌落計數法[15]檢測益生菌數量。

1.3.8 單因素試驗及正交試驗設計

由孟岳成[22]研究結果可知，果膠的添加量0.3 %時，發酵豆乳表面更光滑細膩，冷藏期間更穩定，因此果膠的添加量確定為0.3%。根據預試驗結果，選擇影響大豆益生元發酵豆乳感官品質的主要因素進行單因素試驗及正交試驗設計。根據益生元發酵豆乳的制備方法，采用單因素試驗方案，分別研究豆粉與水的質量體積比、脫脂乳粉添加量、SBOS 添加量、接種量、發酵溫度及發酵時間對大豆益生元發酵豆乳的感官品質的影響，找出每個因素的具體影響規律，并確定影響大豆益生元發酵豆乳品質的主要因素的最優水平變化范圍。根據單因素試驗結果，以大豆益生元發酵豆乳的感官評價為考察指標，按表1 進行六因素五水平的正交試驗，篩選大豆益生元發酵豆乳的最佳工藝條件，并進行最佳工藝條件的驗證試驗。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.9 大豆益生元發酵豆乳的感官評價

以大豆益生元發酵豆乳的表觀、氣味、風味及質地[23]為評定指標。通過經培訓過的10 位評價員，獨立進行專家問卷打分，評定每個樣品間用清水漱口，每人的各項指標得分相加為總分，滿分為100 分，取每位評價員總分的平均分為感官評分值，最后統計得出綜合評分。大豆益生元發酵豆乳的感官評價標準見表2。

表2 大豆益生元發酵豆乳的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of soybean prebiotic fermented soymilk

1.4 數據分析

數據處理方法應用SPSS 17.0 統計軟件，測定指標均表示為3 次平行試驗的平均值，差異顯著性采用Student-t 檢驗處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 豆粉與水的質量體積比對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響

豆粉與水的質量體積比對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響見圖1。

圖1 豆粉與水的質量體積比對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響Fig.1 Effects of ratio of mass to volume of soybean and water on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

大豆通過氣流粉碎機處理后，細胞的比表面積和孔隙率均增大[16]，益生元發酵豆乳的口感與功能性均可得到改善。由圖1 可知，隨著質量體積比的增加益生元發酵豆乳感官評分呈現先上升后下降的趨勢。當質量體積比達到1 ∶12（g/mL）時，益生元發酵豆乳口感細膩，無粗糙的顆粒感，顏色呈乳白色，感官評分達到最高值。當質量體積比超過1 ∶12（g/mL）時，益生元發酵豆乳感官評分呈下降趨勢，乳清析出影響了感官品質。因此，選擇豆粉與水的最佳質量體積比為1 ∶12（g/mL）。

2.1.2 脫脂乳粉添加量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響

脫脂乳粉添加量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響見圖2。

圖2 脫脂乳粉添加量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響Fig.2 Effects of skim milk powder addition on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

豆乳中添加牛乳可以促進豆乳發酵，同時去除讓人不愉快的異味，改善益生元發酵豆乳風味，提高感官品質。由圖2 可知，隨著牛乳添加量的增加，益生元發酵豆乳的感官評分逐漸升高，當脫脂乳粉添加24%時，益生元發酵豆乳風味獨特，感官評分最高；當脫脂乳粉添加量繼續增加，感官評分逐漸下降，這是由于奶油味影響益生元發酵豆乳的感官品質。因此，選擇脫脂乳粉最佳添加量為24%。

2.1.3 SBOS 添加量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響

SBOS 添加量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響見圖3。

由圖3 可知，隨著SBOS 增加量的增加，益生元發酵豆乳感官評分先上升后下降，當SBOS 添加量為25%時益生元發酵豆乳的風味酸甜適中、凝乳堅實、表面及切面光滑細膩，感官品質最佳。當SBOS 添加量超過25%，益生元發酵豆乳酸化嚴重，影響其感官品質。因此，選擇SBOS 最佳添加量為25%。

圖3 SBOS 添加量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響Fig.3 Effects of SBOS addition on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

2.1.4 發酵時間對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響

發酵時間對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響見圖4。

圖4 發酵時間對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響Fig.4 Effects of fermented time on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

由圖4 可知，當發酵7.0 h 時益生元發酵豆乳的風味酸甜適中、凝乳堅實、表面及切面光滑細膩，感官品質最佳。當發酵時間超過7.0 h，益生元發酵豆乳酸化嚴重，影響其感官品質。

發酵期間各組分糖的變化見圖5。

由圖5 可知，發酵5.5 h 蔗糖的保留率為72.55%，隨著發酵時間延長蔗糖保留率也在降低，當發酵7.0 h時蔗糖保留率低至9.42%，棉子糖與水蘇糖的保留率分別為64.11%和94.01%，益生元的保留率為86.53%，蔗糖的消耗率為90.58%，此時結束發酵。由于發酵7.0 h 后蔗糖消耗速度逐漸緩慢，功能性SBOS 參與發酵，保留率也逐漸降低，無法達到提純功能性SBOS 的目的。因此，最佳發酵時間確定為7.0 h。

2.1.5 接種量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響

接種量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響見圖6。

圖5 發酵期間各組分糖的變化Fig.5 The curves of the change of sugars of each component during the fermentation

圖6 接種量對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響Fig.6 Effects of inoculum concentration on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

接種量的大小是影響益生元發酵豆乳感官品質的關鍵因素。接種量過低會延長發酵時間，益生元發酵豆乳產酸速度慢易受細菌污染；接種量過高發酵速度加快，益生元發酵豆乳過酸影響感官品質。由圖6可知，接種量為1%～5%時，感官評分呈上升趨勢，當接種量為5%時，感官評分達到最高，接種量為5%～11%時，感官評分逐漸下降。因此，選擇最佳接種量為5%。

2.1.6 發酵溫度對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響

發酵溫度對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響見圖7。

發酵溫度是影響益生元發酵豆乳感官品質的重要因素之一。溫度過低，干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的增長速度變得緩慢，益生元發酵豆乳風味差，質地松軟；溫度過高，干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的生理活性受到抑制，益生元發酵豆乳有豆腥味，發酵豆香味不足。由圖7 可知，發酵溫度為31 ℃～37 ℃時，感官評分逐漸上升，當發酵溫度為37 ℃時，感官評分達到最高，發酵溫度為37 ℃～41 ℃時，感官評分呈下降趨勢。因此，選擇最佳發酵溫度為37 ℃。

圖7 發酵溫度對大豆益生元發酵豆乳感官品質的影響Fig.7 Effects of fermented time on the soybean prebiotic fermented soymilk quality

2.2 正交試驗

2.2.1 L25（56）正交試驗結果、極差及方差分析

正交試驗結果及極差分析見表3。

表3 正交試驗結果及極差分析Table 3 The orthogonal experiment results and range analysis

續表3 正交試驗結果及極差分析Continue table 3 The orthogonal experiment results and range analysis

由表3 可知，影響大豆益生元發酵豆乳感官品質的因素主次順序為 RD＞RC＞RF＞RE＞RA＞RB，再以 K 值進行分析 A4＞A3＞A5＞A2＞A1、B3＞B4＞B2＞B5＞B1、C3＞C4＞C5＞C2＞C1、D3＞D4＞D5＞D2＞D1、E4＞E5＞E3＞E2＞E1、F3＞F2＞F4＞F5＞F1，因此，制備大豆益生元發酵豆乳的最佳配方是A4B3C3D3E4F3，即豆粉與水的質量體積比為 1 ∶12（g/mL）、脫脂乳粉添加量為24 %、SBOS 添加量為25 %、接種量為5 %、發酵溫度為37 ℃、發酵時間為7 h、干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌比例1 ∶1、果膠的添加量為0.3%、后熟時間18 h。

方差分析見表4。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

2.2.2 大豆益生元發酵豆乳驗證試驗

按上述最佳工藝條件，即干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌比例1 ∶1、果膠的添加量0.3%、豆粉與水質量體積比 1 ∶12（g/mL）、脫脂乳粉添加量 24%、SBOS 添加量25%、接種量5%、發酵溫度37 ℃、發酵時間7 h、后熟18 h 進行3 次平行試驗。結果顯示：3 次試驗結果的誤差較小、穩定性較好，說明正交試驗結果正確可行。大豆益生元發酵豆乳感官評分與益生菌數量如表5 所示。

2.3 發酵豆乳中益生菌數量檢測結果

按制備方法制備發酵豆乳，正常對照組蔗糖的接種量為10%；陽性對照組SBOS 接種量為3 包大豆低聚糖沖劑。正常對照組、陽性對照組與大豆益生元發酵豆乳在形成凝乳后，分別于 0、6、12、18、24 h 采用MRS 瓊脂平板菌落計數法[15]檢測各組分發酵豆乳中益生菌數量。結果如表6 所示。

表5 大豆益生元發酵豆乳驗證試驗結果Table 5 The results of proving experiment of the soybean prebiotic fermented soymilk

表6 發酵豆乳在發酵過程中不同時段的益生菌數量Table 6 The probiotics amount at different time in fermentation process of fermented soymilks

由表5 可知，隨著時間的增加，各組分的發酵豆乳中干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的數量均有升高，正常對照組益生菌數量升高的幅度最小，含功能性SBOS組益生菌數量升高幅度較大，在凝乳后0～12 h 時，益生菌數量升高速度慢；在12 h～18 h 時，益生菌數量迅速升高。在凝乳24 h 時，陽性對照組益生菌數量達到1.93×1012CFU/mL，是正常對照組的 1708 倍；益生元發酵豆乳100 mL 組益生菌數量達到3.03×1013CFU/mL，是正常對照組的26 814 倍；益生元發酵豆乳200 mL組益生菌數量達到4.73×1013CFU/mL，是正常對照組的41 858 倍；益生元發酵豆乳150 mL 組益生菌數量達到7.93×1013CFU/mL，是正常對照組的70 177 倍。因此，功能性SBOS 作為益生元對于干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌的生長具有增殖作用，食用150 mL/d 大豆益生元發酵豆乳對該益生菌生長具有顯著的促進增殖作用（t≤0.05）。

3 結論

按上述制備方法，采用干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌混種發酵大豆低聚糖，優化大豆益生元發酵豆乳制備工藝。通過單因素及正交試驗，制備大豆益生元發酵豆乳的最佳工藝條件，即干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌質量比為1 ∶1、果膠的添加量為0.3%、豆粉與水的質量體積比為1 ∶12（g/mL）、脫脂乳粉添加量為24%、SBOS 添加量為25%、接種量為5%、發酵溫度為37 ℃、發酵時間為7 h、后熟18 h～24 h。此條件下制備的大豆益生元發酵豆乳凝乳堅實、細膩、光滑，風味及口感俱佳。食用150 mL/d 大豆益生元發酵豆乳對益生菌生長增殖顯著，適于免疫力功能下降的老人、腹瀉或便秘人士食用，是一種可以調節腸道有益菌群平衡，保障人體健康的保健型發酵豆乳。