炭疽芽孢桿菌新抗原NlpC的重組表達與免疫評價

胡凱，宰曉東，殷瑛，李汭樺，王美榮，李耀輝，張躍，李玉杰，辜彥霏，徐俊杰

軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

［關鍵字］ 炭疽芽孢桿菌；NlpC蛋白；原核表達；免疫評價；芽孢萌發

炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）是人畜共患急性傳染病——炭疽病的病原體。人類可通過破損皮膚直接接觸、食用受污染的肉類、呼吸道吸入等途徑感染炭疽病。炭疽桿菌的芽孢具有極強的存活能力，對陽光、高溫和消毒劑均有一定的抵抗力，而且炭疽芽孢易于制備、成本低廉，多年來一直被視作潛在的生物武器進行管控，被列為A類生物戰劑[1]。

疫苗是預防炭疽的有效手段，傳統的人用炭疽疫苗主要分為減毒活疫苗和培養上清吸附疫苗。減毒活疫苗以中國的A16R株和俄羅斯的STI株為代表，吸附疫苗以美國的AVA疫苗和英國的AVP疫苗為代表。這2類疫苗均存在有效保護力持續時間較短，對吸入性炭疽感染保護不佳等問題[2]。因此，研發更加安全有效的新型人用炭疽疫苗，對炭疽的預防和控制具有重要意義。

炭疽桿菌感染人體后，通過淋巴和血液循環系統擴散，并分泌大量的外毒素[3]。其外毒素由3種無毒蛋白組成，即保護性抗原（protective antigen，PA）、水腫因子（edema factor，EF）和致死因子（lethal factor，LF）。PA分別與LF或EF結合形成致死毒素和水腫毒素，進而導致水腫和器官衰竭。PA是已知能夠發揮免疫保護作用的最主要成分，基于PA的重組蛋白疫苗顯示了較好的安全性和免疫原性，是當前新型炭疽疫苗研究的重點方向[4-5]。但據文獻報道，采用毒素質粒pXO1和莢膜質粒pXO2均缺失的炭疽減毒菌株作為疫苗仍具有一定的保護效果，證明炭疽的其他抗原成分對免疫保護同樣發揮重要作用[6]。其中S層蛋白EA1[7]、芽孢表面蛋白BclA和BxpB[8-9]、熱激蛋白 GroEL[10]、血紅素轉運蛋白（NEAT）[11]均可以不同程度地提供保護，有望作為炭疽新型亞單位疫苗的候選組分。

NlpC（new lipoprotein C）是炭疽桿菌中的一種細胞壁水解酶，缺失后可導致炭疽桿菌芽孢萌發速度減緩[12]。但NlpC作為抗原是否能夠對炭疽桿菌提供保護國內外尚無報道。本研究中，我們運用生物信息學軟件對NlpC蛋白的常規理化性質進行了分析，在此基礎上構建了NlpC蛋白原核表達質粒，表達純化了NlpC重組蛋白，并對其免疫原性與免疫保護性進行了初步評價，為新型炭疽亞單位疫苗的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡雌性BALB/c小鼠、DBA/2小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；大腸桿菌感受態TOP10、BL21（DE3）購自天根生化有限公司；炭疽桿菌A16R株、質粒pTIG為實驗室保存；2×Easy Tap PCR supermix購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶NotⅠ、EcoRⅠ，T4DNA連接酶購自NEB公司；核酸凝膠回收試劑盒及小量質粒提取試劑盒購自TaKaRa公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒、Western印跡顯影液購自賽默飛世爾科技公司；HRP標記的羊抗鼠IgG、anti-6×His tag購自Abcam公司；His-tag親和層析純化柱購自通用電氣公司；TMB單組分顯色液終止液購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE預制膠購自金斯瑞生物科技股份有限公司。

1.2 NlpC生物信息學分析

應用ProtParam軟件（https://web.expasy.org/protparam/）預測NlpC常規理化性質；應用SignalP-5.0 Server軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽；應用TMHMM軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測跨膜區；應用ProtScale軟件（https://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白疏水性；從NCBI數據庫（https://www.ncbi.nih.gov/）下載炭疽桿菌基因組序列，應用BLAST軟件比對NlpC氨基酸序列，分析抗原保守性。

1.3 NlpC原核表達載體的構建

以NCBI數據庫中炭疽桿菌A16R株NlpC的基因序列（AHE83353.1）為依據，去除其信號肽區域，并在C端加入His標簽。結合表達載體pTIG的序列特點，在上下游分別添加EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點構建引物nlpc-F、nlpc-R。在nlpc基因序列上游和pTIG載體酶切位點下游選取20 bp序列構建鑒定引物對A-nlpc-F、A-pTIG-R。本研究所用引物均在上海生工生物技術服務有限公司合成（表1）。

表1 NlpC原核表達載體構建及鑒定引物

以炭疽桿菌A16R株基因組為模板，用nlpc-F、nlpc-R引物進行PCR擴增nlpc基因（反應條件：98℃ 2 min；98℃ 20 s，56℃ 20 s，延伸 72℃ 1 min，40個循環），所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收后用NotⅠ、EcoRⅠ限制性內切酶雙酶切，酶切片段通過T4DNA連接酶連接到pTIG載體，獲得NlpC表達載體pTIG-nlpc。

1.4 NlpC重組蛋白的表達

將pTIG-nlpc轉化大腸桿菌TOP10感受態，挑取單克隆菌接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、220 r/min過夜振蕩培養；次日用小量質粒提取試劑盒提取質粒pTIG-nlpc，轉化大腸桿菌 BL21（DE3）感受態，挑取單克隆菌接種至5 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、220 r/min過夜振蕩培養；次日按1∶100的比例轉接至新的LB培養基中，37℃、220 r/min振搖至菌液D600nm為0.6～0.8時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導表達5 h；離心收集菌體，進行SDS-PAGE分析。

1.5 NlpC重組蛋白的純化

8000 r/min離心5 min收集IPTG誘導表達菌液的菌體沉淀，用50 mL緩沖液（20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH8.0）重懸，冰上超聲10 min，12 000 r/min離心10 min收集上清，經0.22 μm針頭濾器過濾。用His親和層析柱，以梯度洗脫（洗脫液為20 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH8.0）方式純化目的蛋白。SDS-PAGE鑒定純化蛋白并分析蛋白純度，BCA法定量檢測蛋白濃度。

1.6 NlpC蛋白的免疫原性評價

35只6～8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為7組（每組5只），經皮下注射方式，分別聯合Al（OH）3佐劑或Al（OH）3+CpG佐劑，免疫不同劑量的NlpC（5、10、20 μg/只），設置PBS為對照組。各組于0、14、28 d進行免疫，0、14、28、35 d采血，離心收集血清，ELISA法檢測血清中針對NlpC的特異性IgG抗體。大于陰性血清D值（D=D450nm-D630nm）2.1倍的最大稀釋度作為該樣品的抗體滴度。

1.7 炭疽芽孢的制備

將炭疽桿菌A16R株劃線法接種至LB平板，37℃過夜孵育；挑取單克隆轉接至5 mL LB液體培養基中，37℃、220 r/min搖床中過夜培養；菌液接種至若干LB斜面培養基上，37℃孵育至菌膜基本鋪滿斜面；用1 mL生理鹽水洗下菌體，轉接至裝有LB固體培養基的T75羅氏瓶內，使菌液均勻平鋪在培養基上，37℃正置培養2 h后吸出殘留的液體，倒置培養48 h；28℃繼續倒置培養10 d，用5 mL生理鹽水將菌膜洗下，再經無菌棉片過濾后，65℃處理30 min滅活繁殖體，稀釋后涂平板計數。

1.8 芽孢萌發抑制實驗

將炭疽桿菌A16R芽孢濃度稀釋至5×105/mL，分別取10 μL芽孢加入不同稀釋度（1/1、1/5、1/20）的NlpC免疫血清（40 μL）中，未免疫血清為陰性對照。4℃孵育1 h，取5 μL菌液稀釋并滅活繁殖體后，涂LB平板計數；37℃孵箱中萌發5 min；取5 μL菌液稀釋并滅活繁殖體后，涂LB平板計數。萌發比率=陽性血清芽孢萌發率/陰性血清芽孢萌發率。

1.9 免疫攻毒實驗

32只6～8周齡雌性DBA/2小鼠隨機分為4組（每組8只），經皮下注射方式分別免疫NlpC抗原聯合Al（OH）3+CpG佐劑或PBS（各2組）。于0、14 d進行免疫，0、14、21 d采血，離心收集血清，ELISA法檢測血清中針對NlpC的特異性IgG抗體。首免后28 d分別用炭疽桿菌A16R株芽孢和繁殖體進行腹腔攻毒，觀察小鼠生存情況（表2）。

表2 NlpC免疫攻毒實驗方案

1.10 統計學方法

顯著性分析采用單因素方差分析或t檢驗，生存曲線顯著性分析采用Gehan-Breslow-Wilcoxon檢驗，P＜0.05為有統計學差異。數據統計分析及制圖均采用GraphPad Prism 8.0完成。

2 結果

2.1 炭疽桿菌NlpC蛋白理化性質分析

應用ProtParam軟件對NlpC蛋白常規理化性質進行預測，NlpC蛋白全長為420個氨基酸，相對分子質量43 926.74，理論等電點9.69，平均疏水指數（GRAVY）為-0.348，不穩定系數（Ⅱ）為8.81。應用SignalP-5.0 Server軟件預測信號肽，其N端前26個氨基酸為其信號肽（圖1A）；應用TMHMM軟件預測跨膜區，顯示NlpC蛋白無跨膜區（圖1B），提示NlpC是一種分泌蛋白；應用ProtScale軟件分析蛋白疏水性，其親水性峰明顯多于疏水性峰（圖1C，小于0表示親水，大于0表示疏水），推測此蛋白為親水蛋白。對293株炭疽桿菌基因組中NlpC氨基酸進行比對，所有氨基酸序列的相似性均在90%以上，291株序列相似性大于95%，其中完全一致的有212條（圖1D），表明NlpC具有很高的保守性。

圖1 炭疽NlpC蛋白理化性質分析

2.2 NlpC表達質粒pTIG-nlpc的構建

以炭疽桿菌A16R基因組為模板擴增nlpc基因片段，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增片段大小約1200 bp，與理論值相符（圖2A）?；厥漳康幕蚝笥孟拗菩詢惹忻窫coRⅠ、NotⅠ對片段和pTIG載體進行雙酶切，酶切后的pTIG質粒在1%瓊脂糖凝膠電泳中的移動距離比未酶切質粒短，提示載體質粒被雙酶切為鏈狀（圖2A）。酶切后的片段和載體經T4DNA連接酶連接，獲得NlpC表達質粒pTIG-nlpc（圖2B）。轉化大腸桿菌TOP10，涂板培養后挑單克隆進行PCR菌落鑒定（圖2A），測序結果顯示插入片段序列與nlpc基因的編碼序列完全一致。

圖2 pTIG-nlpc質粒的構建

2.3 NlpC蛋白的表達與鑒定

將構建的質粒pTIG-nlpc轉化大腸桿菌BL21（DE3），經IPTG誘導表達，SDS-PAGE鑒定結果提示NlpC實現了較好的可溶性表達（圖3A）。采用His親和層析柱純化NlpC蛋白后行SDS-PAGE和Western印跡鑒定，結果顯示純化的NlpC蛋白條帶單一，大小符合預期，提示獲得了NlpC蛋白，純度大于95%，可用于后續免疫評價實驗（圖3B）。

圖3 NlpC蛋白的表達與鑒定

2.4 NlpC免疫原性評價

BALB/c小鼠經3次免疫后取血，ELISA法檢測針對NlpC的特異性抗體水平。結果顯示，單獨使用Al（OH）3佐劑時，低、中、高劑量組一免后產生的抗體水平較低，且低劑量組抗體水平低于中、高劑量組；二免和三免后產生的針對NlpC的特異性抗體水平較一免后有顯著提升（圖4A）。用Al（OH）3+CpG佐劑免疫后產生的針對NlpC的抗體水平顯著高于單獨使用鋁佐劑組；二免和三免后的抗體水平較一免后有顯著提升（圖4B）。

圖4 BALB/c小鼠NlpC特異性抗體水平

2.5 芽孢萌發抑制實驗

為了驗證NlpC免疫血清抑制炭疽芽孢萌發的效果，用陰性血清將NlpC免疫血清稀釋至不同濃度，與A16R株芽孢于4℃孵育，移至37℃萌發5 min，65℃處理25 min滅火繁殖體。比較不同組間萌發前后芽孢的數量，分析NlpC免疫血清對炭疽芽孢萌發的抑制情況。結果顯示，經未稀釋的NlpC免疫血清孵育的芽孢萌發比率較陰性血清組低約50%，1/5稀釋的NlpC血清萌發比率與未稀釋NlpC血清萌發比率無差異，1/20稀釋后的NlpC血清無明顯抑制現象（圖5）。

圖5 芽孢萌發抑制實驗

2.6 免疫攻毒實驗

為了評價NlpC對炭疽的免疫保護效果，選用DBA/2小鼠為動物模型開展免疫攻毒實驗。分別于0、14 d免疫NlpC和PBS，首免后14、21 d檢測特異性抗體水平，28 d分別用炭疽桿菌A16R株芽孢和繁殖體進行攻毒，觀察小鼠的生存情況。結果顯示，NlpC抗原在DBA/2小鼠中激發了顯著的體液免疫反應，二免后抗體水平顯著高于一免，抗體效價達7.5×105（圖6A）。用炭疽桿菌A16R株繁殖體攻毒，NlpC免疫組與陰性對照組小鼠集中在1.5 d死亡（圖6B），總體平均死亡時間無統計學差異；用炭疽桿菌A16R株芽孢攻毒，陰性對照組的小鼠集中在2.5 d死亡，NlpC免疫組小鼠總體平均死亡時間較未免疫組推遲約24 h（圖6C），有顯著差異（P＜0.05）。

圖6 DBA/2小鼠免疫攻毒實驗

3 討論

疫苗是預防和控制炭疽的重要手段。我國上市使用的人用炭疽疫苗為無莢膜減毒株A16R，免疫方式為皮上劃痕接種，接種量難以控制，接受度普遍較低。亞單位疫苗是目前炭疽疫苗重要的研究方向，基于保護性抗原的重組疫苗顯示了較好的安全性和有效性。PA是亞單位疫苗的必要成分，但其他抗原也會以某種尚不明確的方式起著重要的保護作用，包含多種抗原的疫苗可能會提供更有效的保護[13]。炭疽桿菌NlpC蛋白是一種細胞壁水解酶，參與維持細胞壁的完整性，與炭疽芽孢的形成和萌發相關。NlpC缺失會導致炭疽桿菌肽聚糖的降解能力降低，芽孢萌發時間延長[12]，但NlpC作為抗原蛋白是否對炭疽桿菌具有免疫保護作用還須進一步探究。

本研究應用多個生物信息學軟件對NlpC蛋白進行分析，結果顯示NlpC是一種穩定的親水性蛋白，有利于后續表達純化。用雙酶切方法構建了NlpC原核表達質粒，經原核系統表達并純化后獲得了純度大于95%的NlpC蛋白。用純化后的NlpC蛋白聯合佐劑免疫小鼠，評價了免疫后產生的特異性抗體水平，發現NlpC具有較好的免疫原性。單獨使用Al（OH）3佐劑時，一免后產生的抗體水平較低，二免和三免后產生的特異性抗體水有顯著提升，用Al（OH）3+CpG佐劑能夠進一步提升抗原免疫后激發的特異性抗體水平。

本研究評價了NlpC免疫血清對A16R株芽孢萌發的抑制作用，在芽孢萌發5 min時，與NlpC免疫血清孵育過的A16R株芽孢的萌發率降低了50%，證實了NlpC免疫血清對A16R株芽孢萌發具有顯著抑制作用。進一步用免疫攻毒實驗評價NlpC誘導的免疫保護效果。由于所選用的炭疽攻毒菌株A16R為減毒疫苗株，僅保留表達毒素的質粒pXO1，因此本實驗選用對毒素更為敏感的DBA/2小鼠（補體C5缺失）用于免疫攻毒評價。NlpC在DBA/2小鼠模型中也顯示了較好的免疫原性，可激發較高的特異性抗體水平。二免后用A16R株芽孢攻毒，小鼠的死亡時間推遲了24 h，用相同劑量的A16R株繁殖體攻毒，未發現死亡時間推遲現象。結果表明NlpC免疫后小鼠生存時間延長的現象可能與芽孢萌發過程受到抑制相關。

不同感染途徑中，炭疽芽孢的萌發是炭疽桿菌入侵人體后至炭疽病產生過程的必要環節。本研究觀察到NlpC免疫血清能夠抑制炭疽芽孢萌發的速度，推遲了用芽孢攻毒后小鼠的死亡時間，是一種潛在的炭疽保護性抗原。但是NlpC免疫小鼠攻毒后仍全部死亡，推測NlpC免疫后能夠推遲芽孢萌發的時間，但無法完全抑制芽孢的萌發。NlpC雖然作為單一抗原對炭疽的保護效果有限，但推遲芽孢萌發可能會為其他保護性抗原發揮作用爭取更多的時間。此外，本研究中攻毒所用的A16R株為毒力減毒株，采用的攻毒劑量較高，現實感染時入侵芽孢數量更少，NlpC可能會發揮更加有效的作用。本研究為NlpC作為一種新型炭疽亞單位疫苗的有效組分研究提供了參考，NlpC聯合PA的免疫效果有待進一步開展評價。