雙酚芴暴露于MCF-7乳腺癌細胞可引起細胞全基因組表達譜改變

齊香榮，黃苑，李桐，王培龍，蘇曉鷗

中國農業科學院 農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081

內分泌干擾物是干擾人類和動物生殖和發育的化學物質[1-2]。近年來，雙酚A（bisphenol A，BPA）已廣泛用于聚碳酸酯塑料和環氧樹脂的制造，并成為應用最廣泛的內分泌干擾物之一[3-4]。研究發現，BPA可以通過各種途徑進入人和動物體內[5-6]，通過發揮類雌激素活性干擾機體的正常生理活動，對機體產生廣泛的毒性作用，包括對生殖系統和神經系統等，尤其對嬰幼兒的生長發育存在潛在危害[7-9]。這些缺點使得BPA在各個國家和地區的應用受到限制。部分國家已經禁止了BPA在嬰幼兒奶瓶以及食品包裝材料中的使用[10]。在這種情況下，一些BPA替代品在商業生產中引起了越來越多的關注。

雙酚芴，學名9，9-雙（4-羥苯基）芴［9，9-bis（4-hydroxyphenyl）fluorene，BHPF］，是BPA的替代物之一，因其特殊的化學結構可以提升聚合物的耐熱性，從而被廣泛用于新型聚碳酸酯塑料產品的合成，在航空航天、汽車制造、電子和醫療器械等行業中得到普遍應用。此外，BHPF也用于與食物接觸材料或容器的生產，用于生產所謂的“不含BPA”的塑料產品。然而，近幾年的研究結果顯示該化合物也對人體有潛在危害。Zhang等發現BHPF存在于“不含BPA”的塑料瓶和人的血清中[11]。此外，BHPF能減輕子宮重量，引起子宮內膜萎縮，對妊娠有不良影響，提示BHPF具有抗雌激素作用；急性接觸BHPF會導致一系列不良影響，如干擾卵母細胞成熟、降低卵母細胞質量等[12]，并對不同物種的卵母細胞具有廣泛的毒性作用[13]；改變斑馬魚幼魚的睡眠/覺醒行為[14]，引起發育異常，延緩心臟形態發生，損害心臟收縮力，BHPF對水生生物的安全構成不可忽視的威脅[15]；小鼠暴露于BHPF，可在不同階段對小鼠的神經行為造成不同程度的破壞[16]。這些結果說明動物和人類能夠暴露于雙酚芴，且雙酚芴可能會對生物體健康產生潛在危害。因此，有必要進一步評價BHPF在體內外的毒性效應及毒性機制，評估其對人體的潛在風險，以指導其在工業生產中的合理應用。

常用的毒性評價方法有動物模型和體外模型2種。體外研究中的細胞培養實驗相比于動物模型，具有高通量、低成本的優點，并可通過化合物誘導的細胞增殖情況探討其雌激素效應[17]。MCF-7乳腺癌細胞雌激素受體表達陽性而且對雌激素敏感，廣泛應用于環境雌激素（例如雙酚類、類固醇類、多氯聯苯類、二噁英類等化合物）的檢測與評價。MCF-7細胞增殖試驗是國外最常用的檢測環境雌激素的方法之一，具有靈敏度高、可同時檢測多種環境雌激素、快速簡便的特點。因此，本研究選用經典的模式細胞MCF-7對雙酚芴進行體外研究，旨在闡明雙酚芴對MCF-7細胞的毒性效應及毒性機制。分析了不同濃度雙酚芴對細胞存活率、細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）及細胞全基因組mRNA表達譜的影響；并通過對差異基因進行KEGG富集通路分析，將差異表達基因富集到相應的細胞信號通路，探討雙酚芴對細胞的分子毒性機制，為進一步驗證雙酚芴對細胞的毒性機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞MCF-7購自商城北納創聯生物科技公司（BNCC）；雙酚芴、雌二醇（17-β-estradiol，E2）購自Sigma公司；胰酶、青鏈霉素雙抗、碳吸附血清、DMEM高糖培養基均購自中科邁晨（北京）科技有限公司；CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）及 TRIzol試劑購自Promega公司；活性氧檢測試劑盒（DCFHDA探針）購自上海碧云天生物技術有限公司；人類4×44K基因表達微陣列v2芯片購自Agilent公司；RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司。

1.2 細胞增殖實驗

MCF-7細胞消化后按10 000/孔接種96孔細胞培養板，于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h，至約80%成片。棄掉培養基，用PBS輕輕洗一次，加入含10%碳吸附血清的無酚紅DMEM培養基及不同濃度的雙酚芴進行處理，分別設置10-5～10-12mol/L 的雙酚芴、陽性對照 E2（10-9mol/L）以及不加藥陰性對照，每個濃度雙酚芴及對照均設置6個復孔。繼續培養24 h后，加入20 μL/孔CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒中的MTS試劑，于細胞培養箱中37℃孵育3 h，酶標儀測定D490nm值，計算各組平均D值和細胞相對存活率。細胞相對存活率（%）=（D暴露組-D空白對照）/（D對照組-D空白對照）×100%。實驗數據以x±SD表示，采用t檢驗，雙樣本等方差假設進行統計分析，設定檢驗水準α=0.05。

1.3 ROS檢測

MCF-7細胞消化后接種6孔細胞培養板，于37℃、5% CO2細胞培養箱內培養24 h至約80%成片。棄掉培養基，用PBS輕輕洗一次，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基及不同濃度的雙酚芴進行處理，分別設置10-5～10-10mol/L的雙酚芴及不加藥陰性對照，每個濃度雙酚芴及對照均設置3個復孔。繼續培養24 h，棄掉培養基，收集細胞，用無血清培養基洗滌一次。采用ROS檢測試劑盒，流式細胞儀檢測。實驗數據以x±SD表示，采用t檢驗，雙樣本等方差假設進行統計分析。

1.4 全基因組表達譜分析

1.4.1 BHPF細胞暴露及細胞收獲 MCF-7細胞消化后接種75 cm2細胞瓶，傳代后24 h（約80%成片）棄掉培養基，加入不同濃度的雙酚芴進行處理，設置不加藥對照。繼續培養24 h后棄掉培養液，加入10 mL/瓶TRIzol試劑，反復吹打幾次后收獲細胞，-70℃保存備用。

1.4.2 芯片雜交 收獲細胞，提取總RNA，用Nano Drop ND-1000定量RNA，標準變性凝膠電泳評估RNA的完整性。樣品標記和芯片雜交根據Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實驗方案（AgilentTechnology）執行。每個樣品的總RNA被線性擴增，使用Cy3-UTP 標記；用 RNeasy Mini Kit（Qiagen）純化標記的cRNAs，并用Nano Drop ND-1000檢測濃度和活性；用人類4×44K基因表達微陣列v2芯片雜交后進行洗滌、固定并掃描。

1.4.3 數據分析 用Agilent Feature Extraction軟件（v11.0.1.1）獲得芯片圖并讀值，得到原始數據；用Gene Spring GXv12.1軟件（Agilent Technologies）對原始數據進行Quantile標準化和數據處理；原始數據標準化后經過篩選高質量探針進行進一步分析。2組樣品間具有統計學意義的差異表達基因通過散點圖篩選；2個樣品間差異表達基因通過Fold Change篩選；用R腳本進行層次聚類；用標準的富集計算方法進行Pathway分析。

2 結果

2.1 細胞增殖實驗

不同濃度（10-5～10-12mol/L）的BHPF作用于MCF-7細胞24 h后，對細胞存活率的影響見圖1。10-5mol/L的BHPF作用于MCF-7細胞，與對照組相比可以顯著降低細胞的存活率（P=0.002）；E2陽性對照組具有增殖效應，與對照組相比具有統計學差異（P=0.023）；其他濃度組與對照組相比無統計學差異。

圖1 不同濃度的BHPF作用MCF-7細胞24 h后的細胞存活率

2.2 細胞內ROS檢測

不同濃度（10-5～10-10mol/L）的 BHPF作用于MCF-7細胞24 h后檢測細胞內ROS水平，結果如圖 2。與對照組相比，10-5、10-6mol/L BHPF 組ROS 水平顯著降低；10-7、10-8、10-9、10-10mol/L BHPF組ROS水平均顯著升高。

圖2 不同濃度的BHPF作用于MCF-7細胞24 h后細胞ROS水平

2.3 BHPF引起MCF-7細胞全基因組mRNA表達譜改變

2.3.1 差異表達mRNA分析 總計檢測到30 908條mRNA，用t檢驗進行差異mRNAs篩選，以差異倍數≥2.0為篩選標準，各濃度篩選出表達上調、下調及無明顯差異的mRNA數詳見圖3。利用實驗組與對照組的差異倍數＞2為橫縱坐標的設定值，給出差異表達mRNA的散點圖（圖3）。

圖3 BHPF各濃度組與對照組相比差異表達mRNA散點圖

2.3.2 差異表達mRNA聚類分析 一般來說，同一類樣品能通過聚類出現在同一個簇中，聚在同一個簇的樣品可能具有相似的生物學性質。本研究所展示的聚類圖的上方分枝結構代表樣本的聚類情況，聚類圖下方代表樣本的分組信息，中間的每一個條形代表檢測到的mRNA，其中紅色代表相對高的表達量，綠色代表相對低的表達量。根據芯片檢測到的mRNA數及差異表達的mRNA數，分別做出對應的聚類圖，詳見圖4。

圖4 BHPF各濃度組與對照組相比差異表達mRNA聚類分析圖

2.3.3 差異表達mRNA KEGG Pathway分析 根據分子參與的功能，KEGG Pathway以Pathway Map形式展示每個通路中基因（蛋白質）、小分子等網絡，對上調和下調差異表達基因進行綜合分析以推斷它們參與的通路。差異表達的mRNA通過FISH精確檢驗的計算方法，以P＜0.05作為篩選標準，結果顯示 10-5、10-7、10-9、10-10mol/L 雙酚芴組分別富集到78、7、32、17條通路。挑選P值最小的前10個顯著富集的條目進行圖形化展示，若不足10個，則全部展示（圖5）。

圖5 BHPF各濃度組與對照組差異表達mRNA參與的細胞信號通路

3 討論

傳統毒理學研究認為，污染物達到一定暴露劑量即可對生物體產生毒性效應，而低于安全閾值則不具有相應的毒性。MCF-7細胞增殖方法可以設定化合物的不同濃度對細胞進行暴露，被測物質的濃度可以低至10-11mol/L級水平就可能有明顯的生物效應，是一種比較靈敏且經濟的生物評價方法，而且重現性好。本研究中，BHPF暴露MCF-7細胞24 h后顯示高濃度10-5mol/L可以顯著降低細胞存活率，具有統計學差異。其他濃度組與對照組相比雖沒有統計學差異，但3次重復實驗都顯示10-6mol/L組對細胞生長也具有一定的抑制作用。該實驗表明高于10-6mol/L濃度的BHPF對MCF-7細胞生長具有抑制作用，低于10-6mol/L濃度的BHPF對MCF-7細胞生長無顯著影響。

真核細胞在有氧呼吸過程中，有少量氧不能被完全還原，從而生成了具有較強氧化作用的ROS，包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（HO）及過氧化氫（H2O2）等。正常生命過程中，適量的ROS具有一定的免疫和信號轉導功能，是機體的有效防御系統[18]。但過多的ROS則會使機體產生氧化應激反應，對機體造成損害。大量研究表明內源性雌激素或外源雌激素活性物質暴露可誘導ROS生成，并最終調節細胞增殖/凋亡過程[19-20]。本研究中，10-7、10-8、10-9及 10-10mol/L BHPF 作用于細胞后ROS水平均顯著升高，10-5及10-6mol/L組ROS水平顯著降低。由于10-5及10-6mol/L組的細胞生長被抑制，ROS水平降低也可能是受到細胞生長狀態及細胞數量的影響。

用不同濃度的雙酚芴作用于MCF-7細胞24 h后，發現各濃度的雙酚芴均能引起細胞全基因組mRNA表達譜發生改變，10-5、10-9、10-10mol/L濃度組差異變化較大，10-7mol/L組差異變化較小。對差異表達的上調、下調mRNA進行KEGG Pathway聚類分析，可以將差異基因富集到相應的細胞信號通路，雙酚芴作用于MCF-7細胞可能通過這些細胞信號通路參與對細胞的內分泌干擾效應及毒性效應。根據初步分析結果，后續研究將重點針對NOD受體信號通路、雌激素信號通路、自噬、神經活性配體-受體相互作用信號通路以及磷脂酰肌醇-3-羥激酶等信號通路上的相關基因及蛋白做進一步驗證，為雙酚芴對MCF-7細胞的毒性機制提供理論基礎。