小鼠視神經損傷模型建立及重組人神經生長因子療效評價

朱丹妮，楊佳蕾，吳詩坡，李瑤，陳旖，張金龍，宋小紅，侯利華

1.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071；

2.國家神經系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100070

視神經源于視網膜的神經節細胞層，由視網膜神經節細胞的軸突匯集而成[1]。視神經是中樞神經系統的一部分，由于其解剖學上的特殊性，常被用于研究中樞神經的損傷和再生[2]。

視神經損傷（optic nerve crush，ONC）后，軸突難以自行再生[3]，導致視功能出現不可逆的損失。ONC動物模型的建立有很多方式，包括橫斷損傷、牽拉損傷、擠壓損傷、擊打頭部損傷等。視神經橫斷損傷模型是一種致傷量穩定的模型，但該模型將視神經完全切斷，損傷嚴重，容易傷及眼動脈造成大出血，后續模型研究評價有一定局限性；牽拉法損傷模型手術步驟多、操作繁瑣且創口較大；擊打頭部建立的損傷模式與臨床損傷較為接近，但造模成功率低，實驗動物的致死率較高。常用的視神經夾傷損傷模型有鉗夾傷、球囊擠壓傷和精細鑷夾傷。鉗夾傷可控性好，損傷明確，但不易精確定量，創口較大，適用于兔子和大鼠動物模型[4]；球囊擠壓傷易于操作但需要開顱，創傷較大，且致傷量不易控制[5]；精細鑷夾傷對實驗動物的創傷較輕，神經髓鞘完整且創口較小。C57BL/6小鼠常被用做病理學的實驗動物模型[6-7]，選擇精細鑷擠壓夾傷建立小鼠損傷模型，采用靠近角膜的結膜切口暴露視神經建模，可避開眼底靜脈竇進行夾傷手術，減少手術出血，成本低且操作方便，易于大量開展研究工作。

神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是第一個被發現的具有神經元營養和促軸突生長雙重功能的神經營養蛋白家族成員，在中樞及周圍神經系統形成、發育、正常功能維持和損傷后恢復中起至關重要的作用[8-11]。NGF對損傷中樞神經的保護作用主要包括增加自由基活性[12]、減少凋亡、促進神經元細胞和神經纖維的存活[13-14]、調節鈣通道穩定細胞內Ca2+水平[15]等。與鼠源NGF不同，重組人神經生長因子（recombinant human NGF，rhNGF）利用中國倉鼠卵巢（chinese hamster ovary，CHO）細胞系統表達制備[16]，生產模式不受動物原料限制，不存在異源蛋白污染[17]。用rhNGF滴眼液治療ONC的保護效果尚有待建立動物模型予以評價。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周雄性C57BL/6小鼠購自斯貝福（北京）生物技術有限公司；rhNGF由本實驗室制備；Triton X-100購自Sigma公司；DAPI Fluoromount-G購自Southern Biotech公司；Anti-RBPMS Antibody購自Millipore公司；Goat anti-Rabbit IgG（H+L） ALEXA FLUOR Plus 594購自Invitrogen公司；杜蒙5號鑷（11251-30，F.S.T）；顯微器械（六六視覺）；體視顯微鏡（Leica，M80）；小動物麻醉機（瑞沃德，R540IP）；熒光顯微鏡（BioTek，CYTATION1）。

1.2 建立ONC模型

小鼠用麻醉機誘導麻醉，固定在麻醉面罩手術板上，0.9%氯化鈉注射液清洗雙眼。在近眼尾側下方眼瞼位置剪開球結膜，用顯微眼用鑷鈍性分離結膜暴露視神經。用杜蒙5號鑷在眼球后2 mm處垂直視神經夾持視神經5 s，右眼不做處理。夾傷后將切開的球結膜復位，觀察術后情況：左眼瞳孔散大而右眼瞳孔對光反射正常，雙眼眼底無出血血供恢復正常，涂抹紅霉素眼膏預防感染。

將14只雄性C57BL/6小鼠隨機均分為夾傷5 s組和夾傷10 s組，觀察不同夾傷時長對模型小鼠視網膜神經節細胞（retinal ganglion cells，RGCs）存活的影響。

將30只雄性C57BL/6小鼠隨機均分為5組，即正常組和夾傷后第7、14、21、28 d組，觀察各時間點RGCs的存活率。

整個損傷過程由同一人完成，以保證夾傷視神經的方向和力度的一致性。

1.3 rhNGF滴眼液給藥

將8只雄性C57BL/6小鼠隨機均分為2組，即夾傷后損傷眼滴0.9%氯化鈉注射液（對照組）或90 μg/mL rhNGF（治療組），夾傷后第14 d取視網膜計數RGCs，計算存活率。從術后第2 d開始每天早晚2次滴眼給藥，連續給藥13 d，所有視神經損傷小鼠麻醉機麻醉后進行左眼滴眼液給藥，5 μL滴眼液給藥后小鼠迅速放回籠內并觀察小鼠蘇醒后的狀態。

1.4 取材

小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，暴露心臟，經左心室注射0.9%氯化鈉注射液、4%多聚甲醛固定，在體視顯微鏡下將眼球剪下浸泡在4%多聚甲醛固定液中固定。

1.5 視網膜鋪片和封片計數

眼球在4%多聚甲醛中固定后，PBS清洗，在體視顯微鏡下將視網膜從眼球上分離，將視網膜分成鼻側、顳側、腹側、背側4個象限。將多重剪接RNA結合蛋白（RNA binding protein with multiple splicing，RBPMS）稀釋后，于4℃孵育視網膜過夜；PBS洗滌后免疫熒光二抗避光室溫孵育2 h，加入DAPI Fluoromount-G封片。熒光顯微鏡下，沿每一象限的中線，距視盤凹陷處0.5、1、1.5 mm處各選一區域，4個象限分別采圖，每張視網膜各采圖12張。用Photoshop軟件為每張圖片畫定 0.09 mm2（0.3 mm×0.3 mm）的計數區，用 Image J軟件對每個計數區進行節細胞計數[18]。

1.6 統計學分析

用GraphPad Prism軟件進行制圖和數據分析，數據以x±s表示。2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析法（One Way ANOVA），P＜0.05為具有統計學差異，P＜0.01為具有統計學顯著差異。

2 結果

2.1 小鼠ONC模型的建立與評價

2.1.1 正常小鼠視網膜RGCs的分布 小鼠整個視網膜免疫熒光檢測可觀察到其整體形態。小鼠RGCs分布在整個視網膜的神經節細胞層中，RBPMS鋪染結果顯示RGCs分布均勻且呈放射狀排列，視網膜血管呈網狀分布于視網膜中，血管處無RBPMS陽性細胞分布（圖1）。整個視網膜鋪染結果與文獻報道一致[19]，熒光顯微鏡下可觀察到視網膜視盤中心區域RBPMS陽性細胞分布密集，視網膜邊緣RBPMS陽性細胞分布較稀疏。

圖1 正常小鼠視網膜鋪染

2.1.2 ONC小鼠視網膜RGCs評價 夾傷5 s組和夾傷10 s組在損傷后第7 d的RGCs數量有統計學差異（P=0.0173），5 s組的RGCs數量顯著高于10 s組（圖2）。夾傷5 s組小鼠血供正常且晶體未見渾濁，夾傷10 s組有2只小鼠眼球萎縮至正常小鼠的2/3大小且晶狀體渾濁，可能是夾傷時間太長導致眼動脈損傷[20]，視網膜血供不足缺乏營養從而導致隨后的萎縮，視網膜上出現絮狀異物，RBPMS鋪染無法進行。夾傷5 s組小鼠血供正常，晶體未見渾濁，故選擇夾傷時間為5 s進行后續實驗。

圖2 不同夾傷時間組小鼠視網膜鋪染及細胞計數

損傷后第7、14、21、28 d，以正常組RGCs數目作為對照，計數結果顯示損傷后各時間點RGCs差異有統計學意義（F=962.5，P＜0.0001）。任意2組間采用Tukey法比較，損傷后第7、14、21、28 d組小鼠視網膜中RGCs數目均明顯低于正常組（圖3），差異均有統計學意義（P＜0.0001）；損傷后第21 d組和損傷后第28 d組小鼠視網膜RGCs數目比較差異均無統計學意義（P=0.13）。視神經夾傷后第7、14、21、28 d的RGCs存活率分別為50.38%、23.12%、18.02%、14.53%（圖3），提示在沒有治療干預情況下，ONC后小鼠RGCs存活率持續下降。

圖3 不同觀察時間點小鼠視網膜鋪染及細胞計數

2.2 rhNGF滴眼液治療ONC的初步評價

ONC模型建立后，給予小鼠患側眼睛rhNGF滴眼液（治療組）或0.9%氯化鈉注射液滴眼液（對照組）滴眼。ONC后第14 d小鼠視網膜RGCs計數結果提示，治療組與對照組的差異具有顯著統計學意義（P=0.009），治療組RGCs數目相較于對照組多26.8%（圖4），提示rhNGF滴眼液能夠對夾傷后的視神經提供一定的保護作用，提高RGCs的存活率。

圖4 治療組與對照組小鼠視網膜鋪染及細胞計數

3 討論

視神經纖維受到的機械壓迫阻礙了軸漿運輸，從而導致細胞代謝受損，視神經纖維失去營養及周圍組織的保護而發生進一步損害，導致視神經無法修復[20]。視神經損傷后RGCs凋亡是造成視功能不可逆損害的根本原因。通過擠壓夾傷法可以模擬機械壓迫建立小鼠視神經損傷模型，并通過RGCs數目變化對模型進行評價。

文獻中對視神經的夾傷時間有不同的選擇。Li等[21]使用杜蒙5號鑷選擇在視盤后面大約1 mm處擠壓5 s；Wang等[22]用杜蒙5號細鑷在視盤后約1 mm處擠壓5 s；Moore等[23]用杜蒙5號鑷在眼后1 mm處壓碎神經10 s。本研究中分別做了夾傷5 s和夾傷10 s的對比實驗。夾傷10 s組有2只小鼠眼球萎縮且晶狀體渾濁，視網膜上出現絮狀異物，RBPMS鋪染無法進行，夾傷5 s組小鼠血供正常晶體未見渾濁，故選擇夾傷時間為5 s進行后續實驗。

本研究采用RBPMS作為RGCs計數的標志。RBPMS是RNA結合蛋白家族成員，主要定位于RGCs的細胞核和細胞質中，是哺乳動物RGCs的選擇性標記物[24]。研究表明，RBPMS優于其他識別RGCs的標志物，包括細胞骨架、核蛋白及神經活性肽等，主要原因是在視網膜40個RGCs亞群中RBPMS均高度表達[19]。將視神經夾傷后，軸漿運輸受阻導致RGCs存活率隨時間減少，損傷后第28 d僅剩14%的RGCs存活，證明損傷模型建立成功。

意大利Dompé Farmaceutici S.p.A.公司開發了在大腸桿菌中生產的rhNGF局部制劑，可用于眼部疾病[25]。Di Zazzo等[26]的研究證實該rhNGF滴眼液治療后，神經營養性角膜病變患者的角膜敏感性得到改善，8周后實現了完全的角膜愈合。Sacchetti等[27]證實rhNGF可通過抑制凋亡來促進色素性視網膜炎大鼠視網膜總感光細胞存活。在視神經損傷方面，臨床前研究的大鼠模型實驗數據顯示，高濃度 rhNGF（180、540 μg/mL）對視神經夾傷損傷具有一定的修復作用，損傷14 d后，給藥組相較于空白對照組RGCs多50%左右，但2個濃度間RGCs沒有差異[28]。同時，rhNGF治療神經營養性角膜炎的臨床研究顯示，高劑量給藥組臨床患者的不良反應較重，主要表現為眼部疼痛及瞼炎[29]。目前，較低濃度的rhNGF對小鼠模型的視神經損傷修復作用未見報道。原核系統表達的rhNGF比活性低，真核表達系統可克服錯誤折疊的問題，蛋白比活性和穩定性較好。因此，我們使用ONC模型初步評價了CHO細胞來源的rhNGF滴眼液對擠壓損傷后的視神經損傷小鼠的治療效果，結果顯示給藥13 d后，90 μg/mL rhNGF治療組的RGCs數目顯著高于對照組，提示外源性給予rhNGF可以提高小鼠RGCs存活率，發揮保護性作用。

綜上所述，本實驗用C57BL/6小鼠建立了視神經夾傷損傷模型，具有操作便捷、創傷較輕、重復性好的特點，并基于此初步評價了rhNGF滴眼液治療ONC的保護作用，為進一步探討rhNGF治療機制及藥效評價奠定了基礎。