植物乳桿菌內源性質粒序列分析及其表達載體的構建

方來杉，賴 強，鐘澤民，黃毓茂,*

（1.華南農業大學獸醫學院，廣東 廣州 510642；2.廣州沃德生物技術有限公司，廣東 廣州 510663）

乳酸菌在自然環境中廣泛存在，在人類胃腸道健康中發揮著重要作用[1-3]。乳酸菌可以促進人體胃腸道對乳糖的消化吸收，減少胃腸功能紊亂，增強細胞免疫力，有助于預防結腸癌[4-6]，與人類飲食和健康息息相關。是現代食品、醫療制藥、農牧等行業中具有重要經濟價值的益生菌。

多數乳酸桿菌攜帶有數個質粒，大小不一，其中多數質粒為隱蔽性質粒，少數質粒具有某些特殊功能[7]。目前，已有許多乳桿菌質粒被測序，并用于構建質粒載體，如副干酪乳桿菌的質粒pCD01和pCD02[8]、干酪乳桿菌的質粒pLC494[9]和pMC11[10]、植物乳桿菌質粒pD403[11]和pM4[12]等。乳酸桿菌質粒復制方式為滾環復制和θ復制，通常較小的質粒（＜12 kb）通過滾環方式進行復制[13]。通過對乳酸菌質粒的測序、分析，得到乳酸菌質粒的復制子是構建質粒載體的關鍵。國內開展的乳酸菌天然質粒的分離及功能分析的研究較少，導致利用基因工程手段對乳酸桿菌的改良受到嚴重限制。由于乳酸菌是食品級的益生菌，其攜帶的質粒也是食品級的[14]，不存在食品安全問題。

因此，本研究對從酸菜中分離的植物乳桿菌LP3中的內源性質粒pLP3進行全序列測定及功能分析，并利用該質粒的復制子構建大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒D-pLP3，并研究該質粒的宿主范圍、轉化效率和穩定性。在穿梭質粒pLP3的基礎上加上啟動子PslpA和綠色熒光蛋白（green fl uorescent protein，eGFP）基因，進一步構建乳酸菌表達載體D-pLP3-PslpA-eGFP，并將其轉化至植物乳桿菌，獲得熒光蛋白的表達。該質?？蔀槿樗峋虿僮魈峁┬碌墓ぞ?，為構建具有自主知識產權的乳酸桿菌的表達載體提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌感受態細胞DH5α、植物乳桿菌LP1、植物乳桿菌LP3、鼠李糖桿菌R1、發酵乳桿菌G1、戊糖片球菌ZQ4、乳酸乳球菌NZ9000、嗜酸乳桿菌（ATCC4356）、表達載體pSCPSP均由所在實驗室構建和保存。

1.1.2 試劑

質粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒 美國Omega公司；預染蛋白質分子質量標準（11～180 kDa） 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增酶及基因克隆試劑 大連TaKaRa公司；MRS培養基 青島海博生物技術有限公司；其余生化及分析純試劑 北京鼎國昌盛生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Mini-PROTEAN型蛋白電泳儀、核酸凝膠成像系統、TC-4000型PCR擴增儀 美國Bio-Rad Laboratories公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器公司；ECLIPSE Ts2R型倒置熒光顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計與合成

質粒pLP3、大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒D-pLP3及表達質粒D-pLP3-PslpA的構建過程中涉及的主要引物及其序列，引物信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息Table 1 Primer sequences used in this study

1.3.2 質粒的分離

離心收集植物乳桿菌LP3的菌體，用質粒提取試劑盒提取質粒。不同于說明書的步驟是：用含有60 mg/mL溶菌酶的solution I溶液重新懸浮菌體，并在37 ℃溫育1 h，以破壞植物乳桿菌細胞壁的肽聚糖層。

1.3.3 測序載體的構建

經預實驗確定植物乳桿菌LP3質粒具有EcoRI酶切位點。對該質粒和載體質粒pUC57使用EcoRI進行酶切，并將酶切產物用T4 DNA連接酶連接。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，進行藍白斑篩選，培養18 h后挑取白色菌落培養并提取質粒。經PCR驗證后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 質粒序列注釋

將測序完成的DNA序列用DNAMAN（6.0）軟件進行人工拼接，利用NCBI等國際核苷酸、蛋白質數據庫以及DNAMAN（6.0）、SnapGene（4.0）等生物學軟件對質粒的核苷酸及氨基酸序列進行分析，預測質粒的開放框。將比對完成的DNA序列進行注釋，初步確定質粒復制相關蛋白。再根據現今公布的質粒復制蛋白（Rep）的同源性，構建系統發育樹，推定質粒復制方式。

1.3.5 大腸桿菌-乳酸菌穿梭載體的構建

用引物pUC19-F/R擴增pUC19質粒上的大腸桿菌復制子Ori的DNA片段，在引物pUC19-F的5’端引入PshAI限制性內切酶。引物CmR-F/R擴增pSCPSP質粒上的氯霉素抗性基因CmR片段，在引物CmR-R的5’端引入NheI限制性內切酶。用融合PCR方法（SOE）將兩段DNA片段組合在一起，純化回收融合產物OCR。

PshAI、NheI限制性內切酶對pLP3質粒進行雙酶切反應，純化回收酶切產物。將融合產物OCR和pLP3酶切產物進行連接反應，將連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取轉化子酶切驗證得到正確的重組質粒，命名為D-pLP3。

1.3.6 乳酸菌感受態制備及電轉

參照Mason等[15]的方法制備乳酸菌感受態細胞：將10 μL的穿梭載體D-pLP3和100 μL的乳酸菌感受態細胞混勻，然后以Bio-Rad電轉儀進行電擊轉化。電轉參數1.8 kV、200 Ω、25 μF[16]，脈沖時間約4.0 ms。電轉后以900 μL預冷的SMRS液重懸，冰浴20 min后，置37 ℃孵育3 h。孵育后離心，預留80 μL上清液，重懸菌體，涂布MRS平板（含25 μg/mL氯霉素），37 ℃培養1～2 d。

1.3.7 穿梭質粒宿主范圍、轉化效率和穩定性測定

取500 ng穿梭質粒與各種乳酸菌的感受態細胞混勻，嚴格按照質粒轉化乳酸菌的方案，將穿梭質粒電轉化至各種乳酸菌感受態細胞內，待轉化子37 ℃靜置3 h活化后，涂布于含氯霉素的MRS平板上。37 ℃培養48～72 h，觀察MRS抗性平板是否有穿梭質粒的轉化子菌落。通過計算每微克穿梭質粒的轉化子，測量其轉化效率。

為確定穿梭質粒的穩定性，采用Alvarez-Martín等[17]的方法，具體步驟如下：挑取在含氯霉素的MRS固體平板上的菌落到新鮮的含氯霉素的液體MRS培養基中，過夜培養。按1%接種量接種到新鮮不含氯霉素的MRS培養基中，37 ℃培養12 h。再次按1%接種量接種到新鮮的MRS培養基中，培養12 h，傳代培養直至60 代。稀釋培養好的菌液分別涂布含氯霉素的MRS平板和不含氯霉素的MRS的平板。根據兩平板上面的菌落數計算質粒的穩定性。

1.3.8 乳酸菌表達載體的構建

PCR獲取嗜酸乳桿菌（ATCC 4356）的S層蛋白的啟動子PslpA和信號肽Sig片段，轉錄終止子來源于質粒pMG36e的終止子。在信號肽Sig的引物Sig-R的5'端引入MluI、ScaI、SacII三個限制性內切酶位點，構成多克隆位點結構。用SOE PCR[18]連接構成了外源蛋白表達所需要的基本元件。為驗證該蛋白表達體系是否能表達異源蛋白，選擇增強型eGFP為標靶蛋白。

1.3.9 熒光顯微鏡觀察和蛋白SDS-PAGE鑒定

挑取轉化后的陽性重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP和含空載體D-pLP3的植物乳桿菌LP1接種于MRS液體培養基（含25 μg/mL氯霉素）培養過夜。再將上述過夜培養的菌液按2%的比例接種于適量MRS培養液中，37 ℃培養16 h后，取其菌體制作水浸片，用熒光顯微鏡觀察，x＝485 nm、y＝533 nm的條件下檢測樣品的熒光強度。37 ℃培養24 h后取其上清液，表達上清液中的蛋白經60%飽和硫酸銨溶液，6 000 r/min離心10 min，所得沉淀用0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液重懸濃縮100 倍左右。加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min，待蛋白充分變性冷卻至室溫，取適量上清液加至十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠加樣孔內，進行常規電泳。

1.4 數據圖像的處理

以Primer Premier 5.0的引物設計軟件進行相關引物的設計，以Tanon 1600全自動數碼凝膠成像系統對DNA電泳凝膠、蛋白電泳膠圖像進行采集及分析。以WinPlas 2.7質粒繪圖軟件繪制質粒的圖譜，并以MEGA 6.0構建質粒的系統發育樹。以Nikon NIS-Elements BR專業圖像分析軟件對eGFP蛋白的熒光圖像進行采集與處理。

2 結果與分析

2.1 質粒分離和單酶切圖譜

電泳結果顯示植物乳桿菌LP3的質粒提取液有3 條帶（圖1），提示該菌株攜帶多個質粒。其中一個質粒大小在2 kb左右，另外2 個質粒大小在15 kb以上。將小質粒（2 kb左右）進行純化回收，并命名為pLP3。對pLP3質粒分別采用限制性內切酶EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI進行酶切分析，最終發現該質粒經EcoRI、XhoI、AvrII、SpeI酶切均獲得線性化質粒，而且是唯一的線狀質粒DNA條帶，不存在其他大小的DNA條帶（圖2）。

圖1 植物乳桿菌LP3的質粒Fig. 1 Plasmid profile of L. plantarum LP3

圖2 質粒pLP3酶切結果Fig. 2 Restriction enzyme analysis of pLP3

2.2 質粒序列的驗證

構建的重組質粒PUC-pLP3，在EcoRI酶切位點附近設計引物pLP3-F/R，通過PCR驗證所測序列是完整的（圖3）。

圖3 重組質粒PUC-pLP3的PCR鑒定Fig. 3 Identification of PUC-pLP3 by PCR

2.3 質粒注釋和復制方式推定

2.3.1 質粒注釋

pLP3質粒是雙鏈環狀DNA分子，共2 017 bp，GC含量為37.48%。BLAST比對結果顯示：該質粒的核苷酸序列與植物乳桿菌KLDS 1.0801中的質粒pLD1（2 112 bp，GenBank：FJ755814.1）、pC30il（2 140 bp，GenBank：J03319.1）最為相似，相似率分別為99%與98%。

通過開放閱讀框（open reading frame，ORF）搜索，pLP3有7 個ORF，ORF3編碼一個含317 個氨基酸殘基的蛋白，位于177 888～18 411 130 bp，應為pLP3質粒的Rep蛋白，該Rep氨基酸序列與Lactobacillus的同源性為100%，與植物乳桿菌的質粒Rep蛋白（NCBI Reference Sequence：WP_012569251.1、WP_010889864.1、WP_010889864.1等）的同源性均為99%，317 個氨基酸中有1 個氨基酸不同。ORF5編碼一個含48 個氨基酸殘基的蛋白，位于515～661 bp，其與植物乳桿菌（NCBI Reference Sequence：WP_107724356.1）未知功能的假定蛋白相似性為100%。其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白。目前為止，由于質粒pLP3除具有與復制相關的蛋白外，未發現具有特定功能的蛋白質，因此質粒pLP3應歸為隱蔽性質粒。

ORF3編碼質粒的Rep蛋白，在rep基因下游的10 bp處有一段反向重復序列，該序列是rep基因的轉錄終止信號（transcription termination signal），與pC30il質粒rep基因的轉錄終止信號序列一致。通過重復序列檢索發現pLP3質粒的623～768 bp有9 個重復序列，該重復序列CATGATAATG正向重復了9 次，重復序列可能和質粒的拷貝數有關[19]。在rep基因上游的272 bp處觀察到典型的質粒的復制雙鏈起點（dso），該保守序列為5’-CGG TTTCTTCTTATCTTGATACTATTAGCAACAAC-3’，與RCR質粒pC194家族的dso同源[20]。該質粒的復制單鏈起點（sso）為ssoA類型，其保守序列為TAGCGA/T[21]位于489～494 bp。

2.3.2 質粒復制方式推定

圖4 pLP3質粒圖譜Fig. 4 Physical map of pLP3

將比對完成的DNA序列進行注釋，初步確定質粒復制相關蛋白（圖4）。用植物乳桿菌質粒復制起始相關蛋白RepA和RepB與己公布的質粒復制相關蛋白同源性制作系統發育樹（圖5）。

由植物乳桿菌質粒復制相關蛋白同源性的系統進化樹可知，推測pLP3質粒屬于植物乳桿菌編碼Rep質粒家族1。Rep-1蛋白家族質粒和質粒pC194的Rep均含有3 個保守的Motifs[22]，而且Motifs已被證明是pC194家族質粒復制起始的關鍵[23-24]。經過對pLP3質粒序列分析，發現該質粒的sso、dso位點以及Rep蛋白的Motifs與pC194家族的特征吻合（表2）。因此，推定pLP3的復制方式為滾環復制，屬于pC194家族。

圖5 pLP3質粒編碼的Rep蛋白系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of pLP3 encoded replication proteins

表2 pLP3質粒Rep蛋白Motifs保守序列的比對Table 2 Alignment of protein motifs of pLP3

2.4 穿梭載體的構建及其宿主范圍、轉化效率和穩定性

以克隆載體pUC19為模板，用引物pUC19-F/R擴增pUC19質粒上的大腸桿菌復制子Ori的DNA片段。以pSCPSP質粒為模板，用引物CmR-F/R擴增pSCPSP質粒上的氯霉素抗性基因CmR片段。用SOE-PCR將Ori片段與CmR片段連接構成OCR片段，利用PshAI、NheI兩個限制性內切酶將OCR片段融合在pLP3質粒載體上，將重組質粒轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取轉化子酶切驗證得到正確的重組質粒，命名為D-pLP3。

表3 穿梭質粒D-pLP3在不同乳酸菌宿主中的轉化效率和穩定性Table 3 Transformation ef fi ciency and stability of shuttle vector D-pLP3 in different hosts

為確定穿梭質粒D-pLP3的宿主范圍，將穿梭質粒電轉化至各種乳酸菌感受態細胞內，并計算其在各種乳酸菌的轉化效率和質粒的穩定性。表3表明：穿梭質粒D-pLP3均可在植物乳桿菌LP1和LP3、鼠李糖桿菌R1等乳酸桿菌和乳酸乳球菌NZ9000內成功電轉，獲得相應的轉化子。但在發酵乳桿菌G1、戊糖片球菌ZQ4未能獲得重組質粒的轉化子。穿梭質粒轉化效率介于0.3h102～1.0h103CFU/μg（DNA質量計）之間，比普通的乳酸菌質粒轉化效率略低。

重組質粒在植物乳桿菌LP1、LP3的宿主菌的丟失率約為30%，在乳酸乳球菌NZ9000中丟失率為37%。重組質粒在鼠李糖桿菌R1中經過60 代連續傳代培養后，重組質粒丟失率幾乎達到100%。重組質粒D-pLP3在不同乳酸菌感受態細胞電轉化效率和質粒穩定性的差異，可能與質粒不相容性有關。

2.5 表達質粒構建和熒光蛋白檢測結果

本實驗設計3 對引物分別PCR擴增嗜酸乳桿菌S層蛋白的slpA啟動子、Sig信號肽、pMG36e上的轉錄終止子，根據SOE-PCR的原理將3 個外源基因表達原件，克隆至穿梭質粒D-pLP3，成功構建乳酸菌表達質粒D-pLP3-PslpA（圖6）。依據eGFP蛋白能在藍光的激發下顯示綠色熒光的特性，因此，選eGFP蛋白作為表達質粒的靶標蛋白。

圖6 構建穿梭質粒D-pLP3和表達質粒D-pLP3-PslpA的流程圖Fig. 6 Schematic illustration of construction of shuttle vector D-pLP3 and expression vector D-pLP3-PslpA

重組質粒D-pLP3-PslpA-eGFP電轉至植物乳桿菌，挑取轉化后的陽性重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1和空載體D-pLP3-LP1接種于MRS液體培養基培養過夜，先取16 h重組植物乳桿菌的菌體進行熒光顯微鏡觀察，在藍光激發下，可以觀察到綠色熒光（圖7）。然后取24 h重組植物乳桿菌的表達上清液，經60%硫酸銨沉淀后100 倍濃縮，SDS-PAGE分析。與空載體D-pLP3-LP1的重組菌相比較，重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1的培養上清液可見27 kDa左右的目的條帶（圖8）。說明重組菌D-pLP3-PslpA-eGFP-LP1已成功電轉至植物乳桿菌LP1中，信號肽Sig能夠將eGFP蛋白成功分泌到胞外。

圖7 重組植物乳桿菌eGFP蛋白的顯微鏡觀察（×100）Fig. 7 GFP expression in recombinant L. plantarum (× 100)

圖8 重組植物乳桿菌eGFP蛋白的SDS-PAGE鑒定Fig. 8 SDS-PAGE detection of eGFP from recombinant L. plantarum

3 討 論

植物乳桿菌益生菌在自然界分布廣泛，對多種不同的環境具有高度的適應性[25]，可能由于植物乳桿菌具有較大的基因組和攜帶豐富多樣的質粒有關。植物乳桿菌通常含有幾個質粒，大小介于2～68 kb之間，植物乳桿菌質粒使其具有某些特殊的功能，如糖、氨基酸及檸檬酸代謝；重金屬、抗生素等抗性；細菌素產生與分泌等[26]。隨著分子生物學相關技術的不斷突破，利用植物乳桿菌的隱蔽性質粒構建乳酸菌質粒載體是其基因改造的研究熱點。

本研究從分離自傳統發酵酸菜中的植物乳桿菌LP3中得到一個天然質粒pLP3，該質粒大小為2 017 bp，GC含量為37.48%。進一步通過生物信息學分析質粒pLP3，該質粒編碼7 個ORF，其中ORF3（317 個氨基酸）為復制起始蛋白（RepA），ORF5（48 個氨基酸）編碼一個未知功能的蛋白。其余ORF在GenBank沒有與之相匹配的蛋白，因此質粒pLP3應歸為隱蔽性質粒。根據Rep蛋白的同源性，及其該質粒的sso、dso位點以及Rep蛋白的Motifs與pC194家族進行比較，發現與pC194家族的特征相吻合，推測該質粒的復制方式為滾環復制，屬于pC194家族。乳桿菌RC型復制質粒因具有寬宿主性質，而得到較廣泛地應用[27]，由于pLP3質粒為RC型復制質粒，因此該質粒具有寬宿主性質，能在不同類型的乳酸菌內進行復制。質粒pLP3來自食品級的乳酸菌，質粒本身較小，RC型復制質粒寬宿主性質，這些特性利于其構建為適宜的乳酸菌工程載體。

以質粒pLP3為載體，同時分別以克隆載體pUC19和植物乳桿菌表達載pSCPSP為模板，PCR分別擴增得到大腸桿菌的復制子和氯霉素抗性基因，將兩個基因片段整合至pLP3質粒上，成功構建大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒D-pLP3。將穿梭質粒D-pLP3電轉至不同的乳酸菌感受態細胞，發現該質粒均能在乳酸乳球菌和乳酸桿菌內復制。通過質粒轉化效率和質粒穩定性實驗，發現該穿梭質粒轉化的效率介于0.3h102～1.0h103CFU/μg之間，乳酸菌質粒電轉化效率一般在10～105CFU/μg左右[28]。穿梭質粒比普通的乳酸菌質粒轉化效率略低，可能的原因有：其一，宿主菌株存在的限制修飾系統和CRISPR機制，對未甲基化的外源質粒直接排斥。其二，宿主菌株內可能存在同一不親和群的質粒[10]。其三，限制轉化效率的原因如電壓、緩沖液、不同宿主的DNA甲基化水平、感受態細胞狀態等。影響穿梭質粒D-pLP3穩定性的原因可能是RC型質粒及其衍生載體在復制過程中產生單鏈DNA中間體，容易發生質?；虻闹亟M和損傷，進而引起質粒載體結構和遺傳穩定性降低。而且滾環復制型質粒插入外源DNA片段過大，也會導致其衍生載體的結構穩定性降低。該穿梭質粒經過60 代無抗性連續傳代培養后，發現相比其他乳酸菌而言，穿梭質粒D-pLP3在植物乳桿菌的轉化效率最高、質粒丟失率最低，這可能和質粒的不相容性有關[11]。

乳桿菌S層蛋白啟動子PslpA、Usp45和乳糖脫氫酶啟動子Pldh等均能在乳酸菌宿主中用于異源蛋白的表達[10,29-30]。在穿梭質粒D-pLP3的基礎上加上啟動子PslpA和eGFP基因，進一步構建乳酸菌表達載體D-pLP3-PslpA-eGFP，并用其轉化至植物乳桿菌，成功獲得了熒光蛋白的表達。將重組乳酸菌培養的上清液進行SDS-PAGE檢測，在27 kDa左右觀察到目的蛋白條帶，表明S層蛋白的信號肽Sig能夠將eGFP蛋白成功分泌到胞外。乳酸菌外源蛋白的分泌表達，為乳酸菌口服疫苗的制備提供了有力的論據。雖然該表達載體的抗性篩選基因對質粒載體改造方面具有推動作用，但在食品、疫苗等生產方面的應用受到一定程度的限制。選擇食品級的篩選標記，構建食品級乳酸菌載體是接下來研究工作的重點。

測得植物乳桿菌LP3內源性質粒pLP3的全序列，該質粒全長為2 017 bp，復制方式為滾環復制，屬于pC194家族?；谫|粒pLP3的復制子，構建了大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒D-pLP3，且具有寬宿主性質，質粒丟失率低。同時，表達載體D-pLP3-PslpA有潛力作為乳酸菌研究的重要工程載體和黏膜疫苗表達工具，具有良好的應用前景。