Y-S-Y12發酵液和生物質熱解液混配對辣椒炭疽病的防治及作用機理

王薇, 李泳, 王偉, 邊雪, 李熙英

(延邊大學農學院, 吉林 延吉133000)

辣椒炭疽病是辣椒的主要病害之一，主要危害葉片和成熟的果實，造成落葉和果實腐爛，對辣椒生產威脅很大。目前，辣椒炭疽病的防治主要采用化學防治，但化學防治常導致農藥殘留、環境污染、人畜中毒、農田生態平衡被破壞等一系列社會問題。因此尋找一種對環境友好的防治方法迫在眉睫。

Y-S-Y12菌株是楊樹枝條中分離到的內生菌解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。金海強等[1]研究表明，Y-S-Y12菌株及其發酵濃縮液具有較廣的抑菌譜，Y-S-Y12菌株對人參銹腐病菌的抑菌率為95.01%，其發酵濃縮液對人參銹腐病菌的抑菌率為69.41%， 田間防病效果達到75.79%，同時有促進人參生長作用。

生物質熱解液是農業廢棄物(玉米芯、秸稈、枯枝等)通過干餾得到的煙氣經冷凝獲得的粗產物，進一步精煉提純得到pH較低的淡黃色酸性透明溶液，主要成分有酸類、酚類、醛類和酮類等，還有鉀、鈣、鋅、鎂等微量元素。生物質熱解液在農業上的應用主要包括促進植物生長[2-4]和防治植物病蟲害發生[5-7]等方面。目前，生物質熱解液與化學農藥混用方面有較多研究。韓如月等[8]研究表明，稀釋10倍的木醋液與稀釋1 000倍的農藥惡霉靈按9∶1 復配，對大豆菌核病菌抑菌率最高，達到60%。沈國娟等[9]發現，生物質熱解液與銀法利混用對辣椒疫病有增效防病和減少農藥使用的效果。也有研究表明，生物質熱解液與多菌靈混用，對水稻紋枯病有增效防病和減少農藥使用的作用[10]。楊彪[11]用木醋液與戊唑醇以不同比例混配對蘋果斑點落葉病菌均表現出較好的抑制作用，其中木醋液與戊唑醇以 1∶1.4、1∶2 和 1∶11 比例混配時，增效系數SR 值分別達到14.01、13.78 和 14.88，表現為明顯的協同增效作用。魏琦等[12]研究表明，竹醋液分別與咪鮮胺和戊唑醇按5∶1的比例混配后均對蘋果炭疽病的抑菌具有增效作用。

以上研究均為生物質熱解液與化學農藥混用方面的研究，對于病菌拮抗菌發酵濃縮液與生物質熱解液混配對植物病害防治方面的研究，尚未見報道。本研究將Y-S-Y12菌株發酵濃縮液和生物質熱解液混配，篩選出最佳混配比例后，研究最佳比例混配溶液對辣椒炭疽病的防治效果及作用機理，為生物質熱解液在辣椒炭疽病的無公害防治應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar medium, PDA)：100 mL蒸餾水、2 g瓊脂、2 g去皮馬鈴薯、2 g葡萄糖；金氏B固體培養基(King’s B medium, KB)：100 mL 蒸餾水、2 g 蛋白胨、1.5 g瓊脂、0.15 g磷酸氫二鉀、0. 15 g硫酸鎂、1.5 mL丙三醇，pH 7.2。

1.1.2供試菌種 病原菌為辣椒炭疽病菌(Pepper anthracnose)，供試拮抗菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens) Y-S-Y12菌株，均由延邊大學植物病理研究室提供。

1.1.3生物質熱解液 由廣州迪森集團提供，以木屑為原料，中溫快速熱解法制造的生物油，生物油與水按體積比1∶1混合，在0.1 MPa的真空度下蒸餾，收集100～120 ℃時的蒸餾液。

1.1.4辣椒種子 景尖椒3號，購買于延吉種子公司。

1.2 研究方法

1.2.1不同濃度的生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的抑菌試驗 將生物質熱解液原液加入到PDA培養基中，配制為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0、10.0 mL·L-1共7個濃度的生物質熱解液PDA培養基。用打孔器在新長滿的辣椒炭疽病原菌的平板上打出直徑為7.0 mm的病菌菌餅，在含生物質熱解液PDA平板中央放置一片菌餅，以無生物質熱解液的PDA培養基為對照，每個處理5次重復，放入25 ℃恒溫培養箱中培養2 d，用十字交叉法測病菌菌落直徑，計算抑菌率。以熱解液濃度的對數值為橫坐標，抑菌率值為縱坐標，得到毒力回歸方程，由毒力回歸方程計算得出熱解液對辣椒炭疽病菌的EC50值和EC90值。

1.2.2不同濃度Y-S-Y12菌株發酵液對辣椒炭疽病菌的抑菌試驗 將Y-S-Y12菌株接種于裝有100 mL KB培養液的錐形瓶中，28 ℃、120 r·min-1震蕩培養48 h，作為種子菌。按照1%的接種量，在盛有100 mL KB培養液的錐形瓶中加入種子菌，28 ℃、120 r·min-1震蕩培養48 h。將發酵液4 000 r·min-1離心15 min，上清液再次用濾紙過濾，上清液用真空旋轉蒸發器濃縮至10 mL，高壓滅菌后即為發酵濃縮液原液。將Y-S-Y12菌株發酵濃縮液原液配制為濃度1.0、2.5 、3.0、5.0和10 mL·L-1的菌株發酵液PDA培養基。抑菌試驗方法及抑菌率計算同1.2.1。

1.2.3Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液混配的最佳配比篩選 將EC50值濃度的Y-S-Y12菌株發酵濃縮液與生物質熱解液以0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0的比例混配，測定不同混配比例溶液的抑菌率。抑菌試驗方法及抑菌率計算同1.2.1。計算預期抑菌率及毒力比率，計算菌落連續生長第3、4、5 d的毒力比率。

預期抑菌率=(單劑A的EC50劑量實際抑菌率×配比百分率)+(單劑B的EC50劑量實際抑菌率×配比百分率)

若毒力比率明顯大于1，為增效作用；若毒力比率明顯小于1，為拮抗作用；毒力比率為1，則為相加作用。

1.2.4Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液1∶9混劑的毒力測定 篩選發現Y-S-Y12菌株發酵濃縮液與生物質熱解液以1∶9混合處理的效果最佳，將Y-S-Y12菌株發酵濃縮液與生物質熱解液的1∶9混劑(簡稱1∶9混劑)配制為濃度0.2、0.5、1、2.5、5、8和10 mL·L-1的PDA培養基。根據1.2.1的方法建立混劑的毒力回歸方程并計算EC50值和EC90值。所得結果參考Sun等[13]計算共毒系數(CTC)。

混配劑的理論毒力指數(TTI)=單劑A的相對毒力指數×單劑A的混配百分比+單劑B的相對毒力指數×單劑B的混配百分比

若共毒系數明顯大于100，表示增效作用；明顯小于100，表示拮抗作用；接近100，表示相加作用。

1.2.5Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液及1∶9混劑對辣椒果實炭疽病的防病試驗 選擇大小基本一致、無損壞的新鮮紅辣椒，用自來水反復沖洗，自然晾干后用70%酒精進行表面消毒，晾干備用。在果蒂處和中間部位分別用接種針刺3個傷口，設置3組處理，接藥劑24 h后接辣椒炭疽病菌(A)、同時接藥劑和病菌(B)、接辣椒炭疽病菌24 h后接藥劑(C)。

接菌時傷口滴辣椒炭疽病菌菌懸液15 μL，接藥劑時傷口處滴濃度為EC90的生物質熱解液、Y-S-Y12菌株發酵濃縮液及1∶9混劑各20 μL，每個處理10個果實，重復3次，以只接病菌無藥劑處理為對照，以只接無菌水為空白對照。待晾干后用保鮮膜密封保濕置于28 ℃恒溫箱中，每天觀察記錄，出現病斑后統計辣椒發病時的病斑直徑、發病率，計算病情指數和防治效果。

病果分級標準按陳娟芳等[14]的方法稍作修改，病斑直徑用十字交叉法測量。0級：無病斑；1級：0.1 cm≤病斑直徑≤0.4 cm；3級：0.4 cm<病斑直徑≤0.7 cm；5級：0.7 cm<病斑直徑≤1.1 cm，病斑上無霉層或有少量霉層；7級：1.1 cm<病斑直徑≤1.5 cm，病斑上霉層較多；9級：病斑直徑>1.5 cm，病斑上有大量霉層。

病情指數=

1.2.6Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液及1∶9混劑處理后辣椒炭疽病菌生理指標測定 取PDA培養基上培養8 d的辣椒炭疽病菌菌絲，進行生理指標測定。電導率測定采用吳方麗[15]的方法；細胞蛋白質和核酸類物質外滲的測定參照徐俊光[16]；總糖含量的測定采用蒽酮試劑法[17]；用考馬斯亮藍G-250法[18]測定蛋白質含量；采用福林酚法[19]測定蛋白酶活性；幾丁質酶活性的測定參考Boller等[20]；β-1,3-葡聚糖酶活性測定采用余永廷等[21]的方法。

1.2.7平板抑菌試驗 EC90濃度的生物質熱解液、Y-S-Y12菌株發酵液及1∶9混劑分別與辣椒炭疽病菌進行平板抑菌試驗，試驗方法同1.2.1。培養5 d后，取病菌生長受抑制部位的菌絲，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.8Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液及1∶9混劑處理后辣椒葉片抗氧化酶活性測定 春季，將辣椒苗進行田間移栽，株行距為25 cm×40 cm，每株定植2棵，移栽后進行正常田間管理。當辣椒植株開花時，噴濃度均為EC90的生物質熱解液、Y-S-Y12菌株發酵液、1∶9混劑，每隔7 d噴施一次，共噴3次，每株每次噴施50 mL。每個處理10株，重復3次。測定處理后21 d的辣椒葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(hydrogen peroxidase，CAT)活性。POD活性用愈創木酚法[22]進行測定，SOD活性用NBT法[18]進行測定，CAT活性參照王學奎[18]紫外吸收法進行測定。

1.3 數據處理與分析

試驗數據采用Microsoft Excel 2010進行整理和分析，應用SAPSS 17.0采用Duncan多重比較法對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用

由圖1可知，不同濃度的生物質熱解液對辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著濃度的升高有明顯增加的趨勢。當生物質熱解液的濃度為10 mL·L-1時，對辣椒炭疽病菌的抑菌率為100%。根據圖1數據建立生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的毒理方程，為y=0.899 3x+4.198 3，r為0.996 6，大于0.95，說明毒力回歸方程的擬合性較好，有較大的可信度。根據毒力回歸方程求得生物質熱解液的EC50值為2.44 mL·L-1，EC90值為10.14 mL·L-1。說明生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的EC50和EC90濃度為分別為2.44和10.14 mL·L-1。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different small letters indicate statistically significant difference between different treatments at P<0.05 level.圖1 生物質熱解液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用Fig.1 Bacteriostasis of biomass pyrolysis solution on pepper anthracnose

2.2 Y-S-Y12菌株發酵液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用

由圖2可知，不同濃度的Y-S-Y12菌株發酵濃縮液對辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著濃度的升高有明顯增加的趨勢。當Y-S-Y12菌株發酵濃縮液的濃度為10 mL·L-1時，對辣椒炭疽病菌的抑菌率為77.79%。根據圖2數據建立Y-S-Y12菌株發酵液對辣椒炭疽病菌的毒理方程，為y=0.595 7x+4.209 0，r為0.953 0，大于0.95，說明毒力回歸方程的擬合性較好。根據毒力回歸方程求得Y-S-Y12菌株發酵液對辣椒炭疽病菌的EC50和EC90濃度為分別為3.77和32.43 mL·L-1?？梢?，Y-S-Y12菌株發酵濃縮液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用，低于生物質熱解液原液。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different small letters indicate statistically significant difference between different treatments at P<0.05 level.圖2 Y-S-Y12菌株發酵液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用Fig.2 Bacteriostasis of Y-S-Y12 fermentation on pepper anthracnose

2.3 Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液的最佳混配比例篩選

不同Y-S-Y12菌株發酵濃縮液與生物質熱解液混配比例的抑菌結果見表1，可見，不同配比中，隨著Y-S-Y12菌株發酵濃縮液比例的增加，毒力比率整體呈下降趨勢。當混配比例為1∶9和3∶7時連續3 d的毒力比率均大于1；當混配比例為2∶8時，第4、5 d的毒力比率大于1。其中，配比為1∶9時毒力比率最大，說明1∶9混劑的抑菌增效作用最明顯。

表1 Y-S-Y12菌株發酵液與生物質熱解液不同配比溶液的抑菌作用Table 1 Bacteriostasis of mixtures with different ratios of Y-S-Y12 strain fermentation to biomass pyrolysis solution

2.4 不同濃度的1∶9混劑對辣椒炭疽病菌的抑菌作用

由圖3可見，不同濃度的1∶9混劑對辣椒炭疽病菌均有抑菌作用，其抑菌率隨著混劑濃度的升高有明顯的增加趨勢。當混劑濃度為8 mL·L-1時，對辣椒炭疽病菌的抑菌作用最強，達到91.52%，且與5 mL·L-1混劑的效果無顯著差異。

根據圖3數據建立1∶9混劑對辣椒炭疽病菌的毒力回歸方程，為y= 0.995 8x+ 4.449 4，r為 0.981 9，說明毒力回歸方程擬合較好。根據毒力回歸方程求得，1∶9混劑的EC50濃度為1.74 mL·L-1，EC90濃度為6.30 mL·L-1。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有統計學意義。Note: Different small letters indicate statistically significant difference between different treatments at P<0.05 level.圖3 不同濃度的1∶9混劑對辣椒炭疽病菌的抑菌作用Fig.3 Bacteriostasis of different concentration solution with 1∶9 ratio of Y-S-Y12 strain fermentation to biomass pyrolysis solution on pepper anthracnose

可見，Y-S-Y12菌株發酵濃縮液、生物質熱解液、及1∶9混劑的EC50值和EC90值中，Y-S-Y12菌株發酵濃縮液的EC50值最大，為混劑的2.17倍；其次為生物質熱解液，其EC50為混劑的1.40倍；混劑的EC50值和EC90值最小。說明1∶9混劑對辣椒炭疽病菌的抑菌作用最強，其次為生物質熱解液，Y-S-Y12菌株發酵濃縮液對辣椒炭疽病菌的抑菌作用最弱。

根據以上兩種單劑的EC50值和混劑的EC50值，計算的共毒系數為123.98，明顯大于100。進一步說明，1∶9混劑具有明顯的增效作用。

2.5 不同藥液不同處理對辣椒果實炭疽病的防病作用

Y-S-Y12菌株發酵液、生物質熱解液及1∶9混劑3種溶液不同處理的防病結果(表2)顯示，不管哪種藥液，預防性的先處理24 h后再接菌處理(C)的病情指數最低，防治效果最高，其次是同時接菌和處理(B)，而先接菌24 h后處理(A)的病情指數較高，但仍低于對照。Y-S-Y12菌株發酵液、生物質熱解液及1∶9混劑的對辣椒果實炭疽病的防病處理中，A、B、C處理時，均為1∶9混劑的病情指數最低，防治效果最高，C處理達到79.26%，其次為Y-S-Y12菌株發酵液，而生物質熱解液的防治效果最低。

表2 不同藥液不同處理對辣椒果實炭疽病的防病作用Table 2 Prevention of different treatments with Y-S-Y12 strain fermentation, biomass pyrolysis solution and their mixture with 1∶9 ratio on pepper anthracnose of pepper fruit

2.6 不同藥液處理對辣椒炭疽病菌生理指標的影響

由表3可知，不同處理的辣椒炭疽病菌菌絲電導率值、蛋白質和核酸類物質外滲濃度均顯著高于對照。其中1∶9混劑處理過的辣椒炭疽病菌菌絲的電導率值最高，達到對照的2.05倍；其次為生物質熱解液處理，達到對照的1.53倍。1∶9混劑和生物質熱解液處理過的辣椒炭疽病菌的蛋白質和核酸類物質外滲濃度最高，蛋白質外滲濃度分別為對照的1.98和1.91倍；核酸外滲濃度分別為對照的1.76和1.68倍。說明1∶9混劑對辣椒炭疽病菌菌絲細胞膜的破壞性最強。

測定炭疽菌病菌的總糖含量和蛋白質含量可以看出病菌菌絲細胞膜是否被破壞，幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶等病原真菌細胞壁降解酶是植病生防檢測的重要因素。由表3可知，不同處理的辣椒炭疽病菌菌絲的總糖含量和蛋白質含量顯著低于對照，其中1∶9混劑處理的總糖含量和蛋白質含量最低，分別是對照的54.45%和89.39%；其次為兩種單劑處理的總糖含量和蛋白質含量。不同處理的辣椒炭疽病菌菌絲的蛋白酶、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性顯著高于對照，其中1∶9混劑處理的蛋白酶、幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性最高，分別是對照的3.37、3.17和1.67倍。

表3 不同藥劑對辣椒炭疽病菌生理指標的影響Table 3 Effects of Y-S-Y12 strain fermentation, biomass pyrolysis solution and their mixture with ratio of 1∶9 on physiological indexes of pepper anthracnose

2.7 不同藥液處理對辣椒炭疽病菌菌絲形態的影響

由圖4可知，在正常PDA培養基培養的辣椒炭疽病菌菌絲形態結構完整，分叉、分隔明顯；而經生物質熱解液處理的菌絲彎曲變形；經Y-S-Y12菌株發酵液處理的菌絲膨大，分支減少；經1∶9混劑處理的菌絲部分呈不規則膨大、溶菌、分叉處膨大、菌絲變短。

注：A：對照；B：生物質熱解液；C：Y-S-Y12菌株發酵液；D：1∶9混劑。紅色箭頭表示菌絲稍微彎曲，黃色箭頭指菌絲膨大，藍色箭頭指溶菌。Note: A: CK; B: Biomass pyrolysis solution; C: Y-S-Y12 fermentation; D: Mixture with ratio of 1∶9. Red arrow indicates hypha slightly curved, yellow arrow indicates hyphal expansion, and blue arrow indicates hypha dissolved.圖4 不同處理的辣椒炭疽病菌的菌絲形態Fig.4 Morphology of pepper anthracnose in different treatments

2.8 不同藥液處理對辣椒葉片POD、SOD、CAT酶活性的影響

由表4可知，不同處理的辣椒葉片中SOD、POD和CAT酶活性均顯著高于對照。其中1∶9混劑處理的SOD、POD和CAT酶活性最高，分別為對照的1.26、2.26和2.70倍。生物質熱解液處理的SOD、POD和CAT酶活性分別為對照的1.02、1.93和1.53倍；Y-S-Y12菌株發酵液處理的SOD、POD和CAT酶活性分別為對照的1.10、1.57和2.28倍。

表4 不同處理對辣椒葉片POD、CAT、SOD酶活性的影響Table 4 Effects of different treatments on activities of POD, CAT, and SOD in pepper leaves

3 討論

本研究中，與木醋液理化性質相似的生物質熱解液在不同濃度下對辣椒炭疽病均有明顯的抑制作用，且隨著濃度的升高抑菌效果有明顯的增加趨勢，當生物質熱解液的濃度為10 mL·L-1時抑菌效果最好，達到100%；辣椒果實炭疽病的防病試驗中先用生物質熱解液處理24 h后接病菌的防效達到52.30%。說明生物質熱解液在辣椒炭疽病無公害防治中有一定的開發利用價值。Y-S-Y12菌株發酵濃縮液和生物質熱解液1∶9配比的EC50值明顯小于Y-S-Y12菌株發酵濃縮液和生物質熱解液單劑EC50值，其共毒系數為123.98，明顯大于100，說明Y-S-Y12菌株發酵濃縮液和生物質熱解液1∶9混配具有明顯的增效作用。辣椒果實炭疽病的防病試驗表明，先用Y-S-Y12 菌株發酵濃縮液與生物質熱解液1∶9混劑處理24 h后接病菌的防效達到79.62%，進一步證明Y-S-Y12 菌株發酵濃縮液與生物質熱解液1∶9混劑對辣椒炭疽病有明顯增效防病作用。

本研究發現，Y-S-Y12菌株發酵液、生物質熱解液以及1∶9混劑處理的辣椒炭疽病菌菌絲中的幾丁質酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性和蛋白酶活性均顯著高于對照，其中1∶9混劑處理的蛋白酶活性、幾丁質酶活性和β-1,3-葡聚糖酶活性最高，分別是對照的3.37、3.17和1.67倍。說明藥液處理后菌體的保護屏障被打破，使其內部電解質、蛋白質以及核酸等外泄至培養液中，進而使培養液的電導率、蛋白質和核酸含量上升。張慧茹等[23]研究發現，絞股藍內生真菌JY25 發酵液可以使致病大腸桿菌的電導率增加，使細胞膜受到明顯破壞。木霉在和抗生菌寄生中，可產生幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶和蛋白酶，分解植物細胞壁，或分泌葡萄糖苷酶等胞外酶來破壞寄主細胞壁[24-26]。這些研究均與本研究結果一致。同時，電鏡觀察發現，經Y-S-Y12菌株發酵濃縮液和生物質熱解液混劑處理的辣椒炭疽病菌菌絲部分呈不規則膨大、溶菌、輕微彎曲、分隔不明顯、分叉處膨大、菌絲變短，這進一步證明菌體生長受到威脅。

SOD酶、POD酶、CAT酶是植物體內重要的保護酶，與植物體抗病性相關。本研究結果表明，Y-S-Y12菌株發酵濃縮液、生物質熱解液以及1∶9混劑處理的辣椒葉片SOD酶、POD酶、CAT酶活性均明顯高于對照，其中1∶9混劑處理的SOD、POD和CAT酶活性最高，比對照分別提高了1.26、2.26和2.70倍。這與前人[27-31]的研究基本一致。說明Y-S-Y12菌株發酵液和生物質熱解液以及它們的混劑處理可以誘導辣椒植株抗病性提高。

噴施Y-S-Y12菌株發酵濃縮液和生物質熱解液1∶9混劑不僅可以直接作用于病原菌，使其細胞膜和細胞壁受到破壞，抑制其生長，還能夠提高辣椒植株體內保護酶的活性，提高植物的抗病性，內因和外因的共同作用使得噴施1∶9混劑后的植物體病害明顯降低，從而有效抑制了辣椒炭疽病的危害。