非整倍體結腸癌對順鉑的耐藥性研究

張漢卿, 劉 穎, 房 曉

(1. 揚州大學醫學院, 江蘇 揚州, 225001; 2. 揚州大學臨床醫學院, 江蘇 揚州, 225001)

Boveri T[1]最早在人類腫瘤組織中發現了非整倍體現象，如今非整倍體已被確認為腫瘤細胞的一大基本特征，超過70%的人類腫瘤中都存在非整倍體[2-3]。紡錘體檢驗點蛋白如MAD2、BUB1B等表達異常、中心粒異常擴增和微管著絲粒動力學改變等都可以導致細胞產生非整倍體[4-6]。臨床研究結果[7-8]表明，非整倍體腫瘤患者對化療藥物普遍具有耐藥性。順鉑是目前臨床上應用最廣泛的一種化療藥物，在結腸癌治療中的療效肯定[9]。本研究在實驗室已具備可通過Tet-on系統誘導MAD2短發夾RNA(shRNA)表達以產生非整倍體的HCT116. △MAD2細胞系的基礎上[10]，通過觀察順鉑處理整倍體組與非整倍體組結腸癌細胞后生長和凋亡情況，探討非整倍體結腸癌細胞是否對順鉑具有耐藥性，現將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞系、試劑

順鉑購自美國Sigma-Aldrich公司; 人結腸癌細胞系 HCT116由北京蛋白質組研究中心惠贈; DMEM細胞培養基和血清(Gibco, 美國); 青霉素/鏈霉素雙抗溶液(Gibco, 美國); CCK-8 細胞增殖活性檢測試劑盒(Vazyme, 中國); GAPDH抗體(Proteintech, 美國); Caspase-3抗體(Cell signaling, 美國); 鼠二抗和兔二抗(ABclonal, 中國); RNA提取試劑盒(Vazyme, 中國); 反轉錄試劑盒(Thermo, 美國); SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Vazyme, 中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與細胞模型驗證: 結腸癌細胞HCT116. △MAD2培養于含有10%的血清和1%雙抗的DMEM完全培養基中，培養條件為37 ℃、5%CO2。等數量細胞分至2個皿，其中細胞經多西環素(Dox)誘導為敲低MAD2表達的為Dox(+)組(非整倍體)，未經Dox處理的為Dox(-)組(整倍體)。Dox處理時間為12 h, 處理當天為第0天，第1天撤藥。第6天進行染色體滴定實驗，進行拍照并計數出每個細胞中染色體數目。采用Western Blot實驗檢測2組細胞第3、6天的MAD2表達情況。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性: 將2組細胞以8.0×105cells/孔的密度鋪入96孔板，隨后以0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L的順鉑梯度濃度處理48 h。隨后各組細胞中均加入10.0 μL CCK-8溶液，繼續培養1 h后，使用酶標儀450 nm波長測量吸光度。同步進行細胞計數實驗，順鉑處理濃度為0、5.0 μmol/L。

1.2.3 Western Blot檢測蛋白表達水平: 收集0、5.0 μmol/L順鉑處理48 h的Dox(+)組與Dox(-)組細胞(共4組細胞)，并于第8天使用8.0 mol/L尿素裂解液置于冰上裂解細胞后進行超聲，以Bradford法定量蛋白濃度。隨后以每孔上樣量60.0 μg、濃縮膠6.0%、分離膠12.0%的條件進行電泳。使用濕轉方法在硝酸纖維膜上進行轉膜，轉膜條件為80 V、2 h。轉膜后以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，隨后4℃下一抗敷育過夜 (一抗濃度: α-TUBULIN為1∶2 000，Caspase-3為1∶300)。于室溫下孵育二抗2 h(二抗稀釋濃度為1∶1 000), 使用Vazyme顯影液進行顯影。

1.2.4 實時熒光定量即時聚合酶鏈鎖反應(qRT-PCR)實驗檢測細胞凋亡基因表達: 順鉑處理48 h后，使用Vazyme RNA試劑盒進行提取，隨后使用Thermo試劑盒兩步法進行cDNA反轉，最后按照Vazyme說明書進行熒光定量。使用美國ABI公司的Step One Plus實時熒光定量PCR系統檢測凋亡相關基因BAX、PUMA、NOXA的mRNA表達情況。

1.3 統計學意義

2 結 果

2.1 細胞模型驗證

實驗室已具備HCT116. △MAD2細胞系，在該細胞系中加入Dox誘導，可表達MAD2 shRNA以干擾紡錘體檢驗點功能產生非整倍體，而Dox撤藥后MAD2恢復表達，而非整倍體則一直存在[10]。使用Dox處理細胞(第0天)12 h后撤藥，通過Western Blot實驗驗證第3天時MAD2蛋白明顯敲低，第6天時MAD2蛋白恢復表達，見圖1。因此，第6天進行后續實驗觀察，可以排除MAD2表達對實驗觀察的干擾。染色體滴定實驗表明，Dox(+)組多為非整倍體細胞，而Dox(-)組多為整倍體細胞，見圖2。

2.2 非整倍體細胞對順鉑具有耐藥性

臨床研究[11]發現腫瘤非整倍體比例高的患者預后較差。在細胞中誘導非整倍體產生后，以不同濃度順鉑處理細胞，通過CCK-8實驗和細胞計數實驗檢測發現, Dox(+)組細胞較Dox(-)組細胞對順鉑具有耐藥性。見圖3、4。

2.3 非整倍體細胞經順鉑處理后凋亡蛋白表達情況

Western Blot實驗發現, Dox(+)組細胞的耐藥性與其經順鉑處理后凋亡蛋白表達較低有關，見圖5。通過qRT-PCR實驗進一步驗證順鉑處理后Dox(+)組細胞較Dox(-)組細胞凋亡基因PUMA、NOXA、BAX表達顯著減少(P<0.05或P<0.01), 見圖6。

圖1 第3、6天時Dox(+)組與Dox(-)組MAD2表達情況

圖2 Dox(-)組與Dox(+)組染色體數目比較

與Dox(-)比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖3 CCK-8實驗檢測順鉑處理后整倍體組與非整倍體組細胞生長活性比較

3 討 論

研究非整倍體對化療藥物的耐藥性需要排除遺傳背景的干擾。研究[12-14]表明，當紡錘體組裝檢驗點蛋白如MAD2、BUB1和CENPE等異常表達時，會導致姐妹染色單體異常分離形成非整倍體。本課題組通過Tet-on系統短暫敲低MAD2表達以構建一個以非整倍體為主要異常的結腸癌模型，進而使得非整倍體的耐藥性研究可以在很大程度上排除遺傳背景的干擾。在該結腸癌模型HCT116. △MAD2細胞系中，短時多西環素處理可以誘導細胞產生非整倍體，而未經過多西環素處理的細胞則為整倍體對照。本課題組前期研究[10]表明, Dox(+)組細胞中非整倍體比例較Dox(-)非整倍體細胞比例高9倍以上。

與Dox(-)比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖4 細胞計數實驗檢測順鉑處理后整倍體組與非整倍體組細胞數目比較

圖5 順鉑處理后Dox(+)組與Dox(-)組細胞凋亡蛋白表達情況

本課題組已對細胞周期特異性藥物羥基脲進行試驗研究，得出結論非整倍體結腸癌對羥基脲產生耐藥性。本研究發現，順鉑作為非特異性細胞周期藥物治療結腸癌細胞時，非整倍體結腸癌對其也具有耐藥性。通過CCK-8實驗和細胞計數實驗可發現, Dox(-)組細胞和Dox(+)組細胞經過順鉑不同濃度梯度處理后, Dox(-)組細胞活性明顯下降。Western Blot實驗中順鉑處理濃度為0、5.0 μmol/L, 順鉑濃度為5.0 μmol/L時Dox(+)組細胞凋亡蛋白Caspase-3表達較Dox(-)組細胞減少。qRT-PCR實驗表明，經順鉑處理后Dox(+)組細胞凋亡基因的表達較Dox(-)組細胞降低，所有實驗結果都表明在同濃度順鉑處理時Dox(+)組凋亡指標較Dox(-)組表達較少。

A: NOXA表達情況; B: BAX表達情況; C: PUMA表達情況。與同組0 μmol/L比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖6 順鉑處理后非整倍體Dox(+)細胞凋亡基因的表達情況

非整倍體腫瘤具有預后差、易遷移和高復發等特性[15-18]。非整倍體結腸癌對臨床各種常用化療藥物的耐藥性機制及其對預后的影響仍需進一步研究。本研究表明非整倍體結腸癌對臨床常用化療藥物順鉑具有耐藥性，經順鉑處理后非整倍體結腸癌細胞凋亡程度較整倍體結腸癌細胞顯著降低。

綜上所述，非整倍體結腸癌對順鉑具有抗藥性，提示腫瘤細胞核型對結腸癌患者臨床化療方案選擇具有重要的參考意義。