球等鞭金藻三級培養過程中細菌群落多樣性分析

孔周雁 張羽帆 凌 婷 曹嘉懿 徐繼林

(1寧波大學海洋學院,浙江 寧波 315211;2浙江省海洋生物工程重點實驗室,浙江 寧波 315211)

優質餌料微藻對提高水產養殖的產量和質量至關重要,也是影響該產業健康發展的關鍵因素之一。餌料微藻除具有營養全面、易于消化、攝食方便等特點,對水質也具有調控作用,是水產養殖中必不可少的天然優質餌料[1]。常用的餌料微藻包括小球藻(Chlorellasp.)、假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)、角毛藻(Chaetoceros gracilis)、扁 藻(Platymonas sp.)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)等。其中,球等鞭金藻是水產養殖業中最重要的餌料微藻之一,其體形小,富含多糖、胡蘿卜素及高能量的脂類物質,尤其富含水產動物生長發育所需的不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid,DHA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)等,且具有無細胞壁容易被水生動物幼體消化吸收的特點[2]。目前,球等鞭金藻已被廣泛用于飼喂貽貝、扇貝等雙殼類動物幼蟲,被認為是雙殼類貝苗、刺參幼蟲及對蝦幼體的優質餌料[3-5]。作為一種具有DHA、EPA 生產潛力的藻種,球等鞭金藻既是水產育苗的良好餌料,也是開發生物活性物質的重要原料,同時也被認為是最有可能實現產業化的微藻之一。因此,關于球等鞭金藻的研究越來越受到重視。

目前國內外對球等鞭金藻的培養仍處于基礎研究階段,尚未實現高效擴繁,微藻高效擴繁的關鍵是控制其培養過程中的環境條件。諸多學者致力于研究光照、鹽度、溫度等環境因素對球等鞭金藻的影響[6-11]。但即使盡量控制適合的環境條件,球等鞭金藻實際培養過程中仍然存在諸多問題。這是因為球等鞭金藻的生長除了受到這些非生物環境因素影響之外,還存在其他重要的影響因子。Bell 等[12]研究發現,藻類在生長過程中會向環境釋放大量的碳水化合物、氨基酸、酶、脂類等多種代謝產物,形成獨特的藻際(phycosphere)微環境,這種藻際環境會吸引大量以細菌為主的微生物,最終組成具有獨特結構與功能的藻際微生物群落。越來越多研究發現海洋微藻與細菌之間存在著非常緊密的聯系,主要表現為協同、共生、抑制、競爭等,且這種緊密聯系具有明顯的種間特異性[13-17]。近年來,藻菌關系的重要性越來越受到重視,相關研究主要集中于水質調控、赤潮或水華防治、重金屬富集等生態問題[18-23],而關于餌料微藻與細菌相互關系的研究較少。

目前,關于不同培養環境下同種微藻的藻際細菌群落多樣性的研究還相對較少。如,有研究分析比較了甲藻(Prorocentrum minimum)不同生長時期(滯后期、指數期和平臺期)的藻際細菌群落組成,發現指數期的甲藻其藻際細菌群落多樣性最豐富[24];Fiona等[25]研究了三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)在四個生長時期和兩種不同的培養基(最小營養培養基和完全營養培養基)中藻際細菌群落分布的差異,發現不同生長時期及兩種不同的培養基中生長的三角褐指藻藻際細菌群落組成均存在顯著差異;Gregory等[26]研究了兩種硅藻,星桿藻和菱形藻(Asterionell opsis,Nitzchia)藻際細菌群落在培養20、200和400 d之間的動態變化,發現硅藻在實驗室培養時,其藻際微生物群落在組成上是相似的,特別是在培養了一年之后,其細菌群落組成保持相對穩定。但目前尚未有利用16S rRNA基因擴增子測序方法系統分析球等鞭金藻藻際細菌群落特征的報道。因此,本研究基于16S rRNA基因擴增子測序技術,分析三級培養過程中的球等鞭金藻藻際細菌群落的多樣性,以期為推進藻菌相互關系的深入研究及提高水產養殖過程中餌料微藻的產量和質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種來源和培養條件

球等鞭金藻3011 來自寧波大學海洋生物實驗室合作單位——福建寶智水產科技有限公司生產基地。按NMB3#配方[27]配置基礎培養基,高溫滅菌后用于一級培養。用于二級培養的海水用漂白精進行簡單滅菌,用于三級培養的海水未進行任何滅菌處理。

1.2 DNA 提取、擴增子測序及分析

收集三級培養過程中的球等鞭金藻3011 藻液,各組分別收集3個樣品重復,樣品采集完成后迅速帶回實驗室。藻液樣品經0.2 μm 無菌聚碳酸酯膜(Millipore,Boston,MA,SA)抽濾,獲得藻際游離和粘附的總細菌。濾膜上的總DNA 利用Power soil? DNA試劑盒(MO BIO Laboratories,美國)按試劑說明書要求進行提取,具體操作參照Xiong 等[28]的方法。將獲得的基因組DNA 送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行細菌16S rRNA 測序,測序區間為16S rRNA基因的V3-V4 高可變區,擴增上下游引物分別為341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTA CNNGGGTATCTAAT-3′)。使用TruSeq DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒(諾禾致源,北京)進行文庫構建,使用Qubit@ 2.0 Fluorometer(Thermo Scientific)和Agilent Bioanalyzer 2100 system對文庫進行質量評估,最后在Illumina HiSeq 2500 平臺上進行雙末端測序。

從測序公司獲得原始數據,使用QIIME(version 1.9.0) 程序對測序結果進行序列過濾[29],利用usearch算法剔除嵌合體。將得到的高質量有效序列采用UCLUST方法聚類成分類操作單元(operational taxonomic units,OTUs),聚類相似度要求為97%[30]。隨后利用RDP Classifier方法將每個OTU 里豐度最高的序列與SILVA 數據庫進行物種注釋分析[31];刪除古菌(archaea)、葉 綠 體(chloroplast)和未 知 序 列(unclassified)。為了消除測序深度不同引起的多樣性評估偏差,將每個樣品的序列數隨機選取均一化到9 911 條(所有樣品中最低測序深度)序列進行后續分析。根據聚類分析結果,進行Alpha 多樣性分析,分析包括以下4種Alpha 多樣性指數:Chao 指數(Chao1)、ACE(ACE 指數)、香濃指數(Shannon)和辛普森多樣性指數(Simpson)。采用基于weighted UniFrac 距離的主坐標分析(principal coordinates analysis,PCoA)和多因素方差分析(Adonis)比較組間群落結構上的差異及顯著性檢驗。

1.3 三級培養過程中可培養細菌的分離

三級培養過程中的球等鞭金藻藻液,按照10倍梯度稀釋成10-1～10-5,將100 μL 各稀釋度樣品均勻涂布于2216E 固體培養基上。28℃恒溫培養箱內倒置培養數日,每天觀察平板上的菌落顏色、形態和大小,挑取代表性單菌落,在新的2216E 固體培養基上進行數次四區劃線分離,直至得到純的單克隆菌株。將確認純化的菌株接種于2216E 液體培養基并加入20%甘油,然后置于-80℃冰箱保存備用。

1.4 三級培養過程中可培養細菌的鑒定

對分離所得的菌株進行菌體形態觀察、染色反應、培養性狀和生理生化測定。采用細菌基因組DNA 抽提試劑盒分別提取所有供試菌株的總DNA。以各細菌提取的DNA為模板,以通用引物27F(5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3′)進行PCR 擴增,擴增反應體系及條件參考朱亞珠等[32]的方法。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產物,使用凝膠回收試劑盒純化,并連接至pMD19-T 載體后送至杭州有康生物技術有限公司測序。

將測序獲得的16S rRNA基因全長序列在NCBI網頁(http:/ /www.ncbi.nlm.nib.gov/)進行BLAST 序列分析及同源性比較,找到同源性最高的序列信息用于構建系統樹來確定分離菌株的分類地位。本研究利用MEGA 5.0軟件的鄰接法(neighbor-joining method,NJ)構建進化樹,自舉值(Boot-strap)設為1 000。

2 結果與分析

2.1 基于16S rRNA基因V3-V4 區域高通量測序的數據統計

本研究通過16S rRNA 擴增子測序鑒定了三級培養過程中球等鞭金藻藻際細菌群落多樣性。采用Illumina HiSeq 測序平臺得到原始下機數據(Raw PE),進行拼接和質控,得到Clean Tags,再進行嵌合體過濾,得到可用于后續分析的有效數據(effective tags)。數據處理過程中各步驟得到的序列統計結果見表1。9個樣品中共產生65 999～80 745 條有效數據,其中一級、二級和三級培養中有效數據的均值分別為77 476、74 286和70 988。所有樣品的有效數據平均長度均為407 或408 nt,且Q20和Q30 都在97%以上,有效數據占原始下機數據的百分比均高于80%。以上結果表明,測序結果質量符合要求,滿足后續分析要求。

表1 高通量測序數據統計Table1 Overview of the high-throughput sequencing result

2.2 球等鞭金藻三級培養過程中藻際細菌群落組成差異分析

利用RDP classifier對注釋的序列進行門、綱、目、科、屬、種6種分類水平上的分析,結果表明,三級培養過程中球等鞭金藻藻際細菌在門類水平上具有較高的相似性(圖1-A)。變形菌門(Proteobacteria)細菌是各級培養中最豐富的細菌群落,它在一級、二級和三級培養組中的相對豐度分別為83.02%、79.38%和74.60%。擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌在這三組樣品中的相對豐度僅次于變形菌門,它在一級、二級和三級培養組中的相對豐度分別為11.50%、12.00%和19.11%。球等鞭金藻其他優勢藻際細菌門類還包括酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、消化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠 彎 菌 門(Chloroflexi)、疣 微 菌 門(Verrucomicrobia)等。在屬水平上,3個培養組的藻際細菌群落組成差異明顯(圖1-B)。除未知屬(Others)外,一級培養組中相對豐度最大的3個屬分別為深海桿菌屬(Thalassobaculum)、圓桿菌屬(Cyclobacterium)和小海員菌屬(Nautella);二級培養組中相對豐度最大的3個屬分別為小海員菌屬(Nautella)、海命菌屬(Marivita)和科迪亞菌屬(Kordia);而三級組中相對豐度最大的3個屬分別為科迪亞菌屬(Kordia)、居水菌(Glaciecola)和硫微螺菌屬(Thiomicrospira)。

圖1 球等鞭金藻三級培養過程中在門(A)和屬(B)水平上細菌菌落的組成Fig.1 The composition of the bacterial community at the phylum (A) and genus (B)levels in tertiary culture process of Isochrysis galbana

2.3 球等鞭金藻三級培養過程中藻際細菌群落結構比較

為探究三級培養過程中球等鞭金藻藻際細菌群落豐富度和多樣性,使用QIIME 程序計算獲得9個樣品的Chao 指數(Chao 1)、ACE 指數(ACE)、香農指數(Shannon)和辛普森多樣性指數(Simpson)。由表2可知,三組樣品間Chao 1和ACE 兩個指數不存在顯著差異,說明一級、二級和三級培養條件中細菌群落的豐富度相近。此外,二級和三級培養條件中Shannon和Simpson 指數也不存在顯著性差異,而一級培養的Shannon和Simpson 指數顯著低于二級和三級培養,說明一級培養組中細菌群落多樣性顯著低于二級和三級培養組。

表2 球等鞭金藻藻際細菌群落多樣性指數Table2 Diversity indices of bacterial community associated with Isochrysis galbana

主坐標分析發現,各級樣品彼此明顯分離,而同組的3個重復聚在一起,說明球等鞭金藻藻際細菌群結構按不同培養級聚類,其中第一軸和第二軸共同解釋了91.02%的群落差異(圖2)。多因素方差分析結果顯示,一級培養和三級培養組之間的細菌群落結構達到了顯著差異水平(R2=0.946,P值=0.001)(表3)。

2.4 球等鞭金藻三級培養過程中藻際細菌群落組間差異物種分析

為研究組間顯著差異的物種,利用MetaStat方法對組間的物種豐度數據進行假設檢驗得到P值,通過對P值的校正,得到q值,最后根據q值篩選具有顯著性差異的物種,并繪制差異物種(具有顯著性差異的未知種除外)在組間的豐度分布熱圖(圖3)。結果表明,隸屬于變形菌門的麥氏交替單胞菌(Alteromonas macleodii)在三級培養組中的相對豐度明顯高于其他兩組,而隸屬于放線菌門的紅球菌(Rhodococcus erythropolis)在一級培養組中的相對豐度明顯高于其他兩組。一級培養組的球等鞭金藻生長顯著好于三級培養組,由此推測麥氏交替單胞菌和紅球菌可能分別是對球等鞭金藻有害和有益的菌種,但需要后續試驗進一步驗證。

圖2 主坐標分析(PCoA)球等鞭金藻藻際細菌在三級培養中的群落結構Fig.2 Principal coordinates analysis (PCoA) of bacterialcommunity associated with Isochrysis galbanaunder three different culture stages

表3 多因素方差分析三組間細菌群落結構顯著性檢驗Table3 Significance test of bacterial community structure among three groups by Adonis

2.5 球等鞭金藻三級培養過程中可培養細菌的分離與鑒定

圖3 球等鞭金藻三級培養下細菌的種水平上差異物種相對豐度熱圖Fig.3 Heat map showed the relative abundance of the significantly changed bacteria associated with Isochrysis galbana at the species taxonomic level

采用2216E 平板分離的方法對三級培養過程中球等鞭金藻藻際環境細菌進行分離,初步分離鑒定到17株外觀明顯差異的細菌(表4),分別編號為Ig-1、Ig-2、Ig-3、Ig-4、Ig-5、Ig-6、Ig-7、Ig-8、Ig-9、Ig-10、Ig-11、Ig-12、Ig-13、Ig-14、Ig-15、Ig-16、Ig-17。對上述17株細菌進行DNA 提取及16S rRNA基因的擴增和測序,將所測得的16S rRNA基因全序列輸入NCBI網頁,用BLAST方法進行序列分析及同源性比較,結果如表4所示。將17株細菌及NCBI 數據庫上與它們相似性最高的細菌的相應分子序列信息用于構建系統進化樹,結果顯示(圖4),整個系統發育樹分成13個分支,分別對應13個屬,包括交替單胞屬(Alteromonas)、假交替單胞屬(Pseudoalteromonas)、海桿菌屬(Marinobacter)等。其中,Ig-2、Ig-3和Ig-4 同屬于交替單胞屬的分支,Ig-2和Ig-3與麥氏交替單胞菌(Alteromona macleodii)親緣關系最近,而Ig-4與交替單胞菌(Alteromonasp.)親緣關系最近。以此類推,與分離得到的細菌親緣關系最近的已知細菌分別對應如下:Ig-1與Bacillus jeotgali、Ig-5與Ruegeriasp.、Ig-6與Ruegeria pelagia、Ig-7與Marinobacter salsuginis、Ig-8與Nautellasp.、Ig-9與Loktanellasp.、Ig-10與Pseudoalteromonassp.、Ig-11與Staphylococcus caprae、Ig - 12與Hoeflea alexandrii、Ig - 13與Psychroserpenssp.、Ig-14與Marinobactersp.、Ig-15與Marinobacter alkaliphilus、Ig-16與Leisingerasp.、Ig-17與Algoriphagus marincola。

3 討論

前期試驗發現球等鞭金藻在三級培養過程中生長差異明顯,在完全滅菌的一級培養中生長最佳,在未滅菌的三級培養中生長最差,在不完全滅菌的二級培養中生長介于兩者之間。為了探究球等鞭金藻生長差異與藻際細菌的關系,本研究通過16S rRNA基因擴增子測序分析了各級培養藻液中細菌群落多樣性,結果顯示,變形菌門細菌在各級培養中均是最豐富的細菌群落。已有不少研究發現變形菌門細菌是藻際環境中最重要的細菌類群之一,其中包含不少對微藻生長有益的細菌[13]。如,隸屬于變形菌門Roseobacter-clade的海洋細菌(Phaeobacter inhibens) 在赫氏顆石藻(Emiliania huxleyi)生長初期為藻提供生長激素,而赫氏顆石藻為細菌提供營養物質,兩者互利共生[33]。此外,同樣隸屬于變形菌門的一株亞硫酸桿菌(Sulfitobactersp.)可以通過分泌吲哚乙酸(indoleacetic acid,IAA) 促進多列擬菱形藻(Pseudo-nitzschia multiseries)的生長[34]。本研究結果進一步證明變形菌門細菌是微藻藻際細菌群落中非常重要的組成部分。

表4 三級培養球等鞭金藻藻液中分離到的細菌信息Table4 The information of bacteria isolated from Isochrysis galbana culture in tertiary culture process

本研究結果表明,三級培養過程中球等鞭金藻藻際細菌在門類水平上具有較高的相似性,但在屬水平上差異較明顯。如,隸屬于Kordia、Thiomicrospira等屬的細菌在三級培養組中的相對豐度最高;而Cyclobacterium屬的細菌在一級培養組中的相對豐度最高。這些在各級培養組之間相對豐度差異明顯的細菌可能與球等鞭金藻生長差異相關。主坐標分析和多因素方差分析結果表明,三級培養環境下的球等鞭金藻藻際細菌組成之間存在明顯差異。關于不同培養環境中的微藻藻際細菌群落分布,之前有類似研究,如室外培養和實驗室培養下的扁藻藻際細菌群落分布存在較大的差異[35]。

本研究利用MetaStat方法對三組間差異物種進行分析,種水平上發現2株相對豐度顯著差異的細菌(未知種除外),其中麥氏交替單胞菌在球等鞭金藻三級培養條件下相對豐度明顯高于一級培養,而紅球菌在一級培養條件下相對豐度明顯高于三級培養。結合球等鞭金藻在各級培養中的生長情況,藻相對豐度高的一級培養中,紅球菌的相對豐度高;而藻相對豐度低的三級培養中,麥氏交替單胞菌的相對豐度低。推測,麥氏交替單胞菌和紅球菌可能分別是對球等鞭金藻生長有害和有益的細菌。為驗證猜想,首先對三級培養條件下可培養細菌進行了分離鑒定。本研究共分離鑒定了17株不同的藻際細菌,其中包括麥氏交替單胞菌,但紅球菌未分出。鑒于以上結果,本研究從兩方面進行分析:一方面,由于2216E 固體培養基分離法比較單一,后續將會通過不同營養配比的改良2216E 培養基、其他培養基及優化培養條件等方法進行大批量的分離工作,以分離得到包括紅球菌在內的其他藻際可培養細菌;另一方面,驗證這一猜想需要進行藻菌共培養試驗,而進行藻菌共培養試驗需要獲得無菌球等鞭金藻藻株。由于球等鞭金藻無菌純化工作存在一定難度,尚未獲得無菌藻株,相關工作還在推進中,因此未能驗證麥氏交替單胞菌和紅球菌對球等鞭金藻生長的影響作用。以上兩方面工作及藻菌互作機制的深入研究將在后續工作中推進。

圖4 基于16S rRNA 序列構建的球等鞭金藻藻際細菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the bacteria associated with Isochrysis galbana based on 16S rRNA sequence

球等鞭金藻是水產養殖產業中最重要的餌料,但國內外對球等鞭金藻的培養仍處于基礎研究階段,尚未實現高效擴繁。藻際細菌作為影響微藻生長的重要因子,關于其影響微藻生長的研究越來越多[13-17]。然而,極少有關于藻際細菌如何影響球等鞭金藻生長等方面的報道,且只是個別菌株對其具有促進或抑制現象的研究[36],缺乏藻際細菌的系統研究,且未涉及互作機制的解釋。本研究利用16S rRNA基因擴增子測序方法系統分析球等鞭金藻藻際細菌群落特征,并分離鑒定了17株球等鞭金藻藻際細菌,發現紅球菌可能是對球等鞭金藻生長有益的細菌。這些結果為篩選促進球等鞭金藻生長的有益菌并探究其促進金藻生長的機制奠定了基礎,將為球等鞭金藻及其他餌料微藻的進一步開發利用、貝類養殖行業的健康發展等提供科學指導。

4 結論

本研究基于16S rRNA基因擴增子測序,分析了三級培養過程中球等鞭金藻藻際細菌多樣性。結果表明,三級培養過程中細菌群落存在顯著差異,進一步分析發現一級和三級培養之間存在2株相對豐度顯著差異的細菌,即麥氏交替單胞菌和紅球菌,它們可能分別是對球等鞭金藻生長有害和有益的細菌。通過2216E平板涂布法分離并鑒定了麥氏交替單胞菌等17株球等鞭金藻藻際環境細菌。本研究結果為進一步探索藻菌關系奠定了基礎,將有助于提高水產養殖過程中球等鞭金藻的產量和質量。