中藥復方對鯽魚細菌性敗血癥的防治效果

田海軍，鄭曙明

中藥復方對鯽魚細菌性敗血癥的防治效果

田海軍1，鄭曙明2

（1. 信陽農林學院，河南 信陽 464000，2. 西南大學動物科技學院，重慶 402460）

【】研究中藥復方對鯽魚（）細菌性敗血癥的防治效果。由茵陳、地錦草、大黃、黃芩、白術、苦參、板藍根按一定比例組成中草藥復方，用索氏提取法以乙醇為溶劑提取中草藥復方的總有效成分，提取物按質量分數0%、0.5%、2.0%，中藥復方原料粗粉按質量分數2.0%的添加量制成藥餌（分別記為0%、0.5%、2.0%藥餌組，2.0%生藥組），投喂人工感染溫和氣單胞菌（）的鯽魚，測定感染4 d和15 d時鯽魚的血清轉氨酶（GPT、AST）、甘油三酯（TRIG）、膽固醇（TC）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比（白蛋白與球蛋白質量濃度比，A/G）等肝功能指標，尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、肌酐（CR）等腎功能指標，心肌功能指標肌酸磷酸激酶（CPK）。2.0%藥餌組在0.5×109cfu/mL和1×109cfu/mL的溫和氣單胞菌攻毒感染下，藥餌防治率分別為82.5%和42.5%，與0%藥餌組相比，藥效極顯著（< 0.01）。相對于對照組（健康魚），感染0.5×109cfu/mL 溫和氣單胞菌病魚（0%藥餌組）轉氨酶、TRIG、TC、TP、ALB、GLB、A/G指標下降（< 0.05），BUN、UA、CR、CPK指標上升（< 0.05），而其他藥餌組各指標均較0%藥餌組改善，恢復至對照組水平。中藥復方對鯽魚細菌性敗血癥有一定防治作用，可改善病魚的肝臟、腎、心肌功能的受損狀態。以添加質量分數2%中草藥復方提取物的藥餌防治鯽魚細菌性敗血癥的藥效顯著。

鯽魚；細菌性敗血癥；血液生化指標；中藥復方；藥效學

細菌性敗血癥是危害水產養殖的主要疾病之一，為暴發性流行病，其危害最重，流行區域廣，流行周期最長，幾乎可殃及所有的淡水魚類，患病魚從出現癥狀到暴發性死亡僅3 ~ 5 d，死亡率高達95%以上，每年因魚類細菌性敗血癥造成的經濟損失高達幾億元[1]。目前用于防治魚類細菌性敗血癥的藥物主要是抗生素、消毒劑等化學藥物，然而化學漁藥的大量使用會影響水體的生態平衡，導致耐藥性病原菌產生，因此急需開發純天然、療效好、無藥物殘留的中草藥制劑，以防控水產養殖生產中的水產動物細菌性敗血癥。用中藥防治魚類病害，成本低廉、綠色環保、無藥品殘留等，符合無公害養殖要求[2]。且實踐證明，作為免疫增強劑，中草藥有利于水產養殖魚類病害的群體防治。對于中草藥藥餌防治水產動物細菌性敗血癥僅見于陳學年等[3-8]的中草藥生藥粉末藥餌防治鯽魚敗血病的試驗，有關復方提取物對魚類細菌性敗血癥的藥效試驗還有待進一步研究。

本課題組依據中醫藥理論及水產動物醫學理論，通過瓊脂–孔洞擴散法藥敏試驗及藥餌防治試驗篩選出對細菌性敗血癥病原菌抑菌效果較佳，由茵陳、地錦草、大黃、黃芩、白術、苦參、板藍根按一定比例組成的中草藥復方[9]。筆者測定健康鯽魚經攻毒感染細菌性敗血癥后的血液生化指標，建立鯽魚細菌性敗血癥血液生化病理模型，通過藥餌對病魚肝、腎、心肌功能以及造血功能的恢復作用研究該中草藥復方的藥效，為魚病防治藥物開發和水產養殖生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚 信陽市水產科學研究所提供健康鯽（），規格均勻，體質量（40±0.5）g。

1.1.2 試驗用菌液 試驗致病菌溫和氣單胞菌（）病株XSKS-2由信陽農林學院微生物實驗室提供，分離自信陽市水產科學研究所養殖場有典型細菌性敗血癥癥狀的鯽魚。通過病株對健康鯽魚的回歸感染試驗，確定溫和氣單胞菌的感染劑量。

1.1.3 藥餌 復方中草藥由下列中藥原料按質量分數配制：茵陳18% ~ 22%，地錦草18% ~ 22%，大黃18% ~ 22%，黃芩8% ~ 12%，白術8% ~ 12%、苦參8% ~ 12%，板藍根8% ~ 12%。復方中七味中草藥原藥購自信陽市仲景大藥房，用超微粉碎機（15 kW）粉碎成原藥粗粉。用索氏提取器以乙醇為溶劑連續回流提取復方中草藥，提取物分別按質量分數0%、0.5%、2.0%添加量均勻噴灑在飼料上制成藥餌（即0%、0.5%、2.0%藥餌組），另外用復方原料粗粉按質量分數2.0%的添加量制成藥餌（2.0%生藥組）。

1.1.4 養殖池 1.2 m × 0.6 m × 0.8 m玻璃缸，不間斷充氧，水溫(23.0±0.5)℃，每天換水量不超過1/3。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 根據預試驗，細菌攻毒試驗選取0.5×109、1.0×109cfu/mL兩個濃度梯度（預試驗攻毒感染發病率為55% ~ 85%），藥餌防治試驗設0%、0.5%、2.0%藥餌組及2.0%生藥組，即并設空白對照組（健康鯽魚，未進行人工攻毒感染，投喂普通飼料），共9個試驗組（表1），每試驗組設2平行組， 1組用于藥餌防治率試驗，另1組用于血液生化指標測定取樣。每組試驗魚40尾，試驗前健康鯽魚先暫養2周，再投喂藥餌1周，然后各試驗組腹腔注射相應濃度的溫和氣單胞菌菌懸液進行攻毒感染試驗。

1.2.2 藥餌防治率 發病后每d記錄各試驗組魚存活數，連續記錄1周。存活率及藥餌防治率結果采用方差分析和檢驗。

表1 試驗區組設計

1.2.3 血液生化指標測定 人工感染后4 d（細菌性敗血癥暴發高峰期）、15 d（細菌性敗血癥病程穩定期）時取1至4組試驗組及對照組共計5組，每組取魚6尾進行尾靜脈采血。用URIT-3000PLUS 全自動血細胞分析儀檢測血清谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、膽固醇（TC）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白球比（A/G）、尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、肌酐（CR）、間接膽紅素（IBIL）、肌酸磷酸激酶（CPK）等血液生化指標[9]。

2 結果與分析

2.1 不同細菌濃度攻毒感染下各藥餌組試驗魚的存活率

在菌液濃度為0.5×109cfu/mL時，2.0%藥餌組鯽魚存活率最高，添加質量分數2.0%復方提取物的藥餌對鯽魚存活率為82.5%；其次為2.0%生藥組，鯽魚存活率為77.5%。在菌液濃度1×109cfu/mL時，2.0%藥餌組鯽魚存活率最高，為42.5%；其次為2.0%生藥組，鯽魚存活率為37.5%（表2）。

經過檢驗及方差分析，在0.5×109cfu/mL及1.0×109cfu/mL菌液濃度下，2.0%藥餌組和2.0%生藥組與0%組差異有統計學意義（< 0.01），0.5%藥餌組與0%藥餌組、2.0%藥餌組和2.0%生藥組之間差異無統計學意義?？傮w而言，在兩種濃度菌液感染下，質量分數2%的復方提取物的藥效均有統計學意義(< 0.01)。

表2 不同藥餌濃度和不同細菌濃度時患病魚的死亡情況

2.2 血液生化指標測定結果

血液生化指標中反映肝臟功能狀態的有轉氨酶、甘油三酯、膽固醇、血清總蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白等，當肝臟細胞受到損傷時血清轉氨酶升高，其他指標下降[10-14]。感染4 d時0%藥餌組（感染細菌性敗血癥的病魚）谷丙轉氨酶活性較對照組（健康鯽魚）顯著下降（< 0.05），其他藥餌組谷丙轉氨酶活性與對照組差異無統計學意義（> 0.05），但高于0%藥餌組（< 0.05）。感染15 d時各藥餌組測定值與對照組相近（> 0.05）（圖1）。

圖2可見，感染4 d時，各組間谷草轉氨酶活性差異均無統計學意義（> 0.05），僅0%藥餌組較對照組有下降趨勢；感染15 d時，各組間谷草轉氨酶活性差異均無統計學意義（> 0.05），僅0%藥餌組較對照組有上升趨勢。

圖3可見，感染4 d時，0%、0.5%藥餌組血清膽固醇低于對照組（< 0.05），2%藥餌組和生藥2%組與對照組差異無統計學意義（> 0.05）；感染15 d時，0%藥餌組血清膽固醇比對照組顯著下降（< 0.05），其他藥餌組與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

Fig.3 Serum cholesterol levels in serum 4 and 15 d after injection

圖4可見，感染4 d時，0%藥餌組甘油三酯比對照組下降（< 0.05），2%藥餌組和生藥2%組高于0%藥餌組（< 0.05），但與對照組無顯著差異 (> 0.05)；感染15 d時0%藥餌組甘油三酯比對照組下降（< 0.05），其他藥餌組高于0%藥餌組（< 0.05），與對照組測定值接近（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

圖5可見，感染4 d時，0%藥餌組血清總蛋白比對照組顯著下降（< 0.05），其他藥餌組高于0%藥餌組（< 0.05），與對照組差異無統計學意義（> 0.05）；感染15 d時，所有實驗組無顯著差異（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

圖6可見，感染4 d、15 d時，各試驗組的血清白蛋白變化一致，均表現為0%藥餌組比對照組顯著下降（< 0.05），其他藥餌組高于0%藥餌組（< 0.05），但與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

圖7可見，感染4 d、15 d時，各試驗組的血清球蛋白變化一致，均表現為0%藥餌組比對照組顯著下降（< 0.05），其他藥餌組高于0%藥餌組（< 0.05），但與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

Fig .7 Serum globulin concentrations in serum 4 and 15 d after injection

圖8可見，感染4 d時，0%藥餌組血清白球比（白蛋白和球蛋白的質量濃度比值）比對照顯著下降（< 0.05），其他藥餌組高于0%組（< 0.05），但與對照組差異無統計學意義（> 0.05）；感染15 d時，0%藥餌組比對照組顯著下降（< 0.05），其他藥餌組高于0%藥餌組（< 0.05），但與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

圖9可見，感染4 d、15 d時，各試驗組血清肌酐變化一致，均表現為0%藥餌組血清肌酐高于對照組及其他藥餌組（< 0.05），但其他各組間差異無統計學意義（> 0.05）。

圖10可見，感染4 d、15 d時，0%藥餌組血清尿素氮濃度比對照組及其他藥餌組顯著上升（< 0.05），其他藥餌組與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（> 0.05）

The data with a same letter means no significant difference (> 0.05)

圖10 感染4、15 d時血清尿素氮濃度

Fig.10 Serum urea nitrogen concentration in serum 4 and 15 d after injection

圖11可見，感染4 d、15 d時，0%藥餌組血清尿酸比對照組及其他藥餌組顯著上升（< 0.05），其他藥餌組與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

由圖12可見，感染4、15 d時，0%藥餌組血清間接膽紅素（造血功能指標）均比對照組及其他藥餌組顯著上升（< 0.05），其他藥餌組與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

由圖13可見，感染4 d、15 d時，0%藥餌組肌酸磷酸激酶（心肌功能指標）比對照組及其他藥餌組顯著升高（< 0.05），其他藥餌組與對照組差異無統計學意義（> 0.05）。

凡含相同字母者表示組間差異無統計學意義（P > 0.05）

3 討論

3.1 復方配伍機制及藥理作用

復方中草藥是以茵陳、黃芩為君藥，茵陳黃芩作為基礎方有清熱利濕、利膽、保護肝功能，解熱，抗炎，改善微循環，并有抗凝血及抑制多種致病性細菌的作用。以大黃、地錦草、板藍根為臣藥，大黃瀉下攻積、清泄濕熱，板藍根抗菌消炎，地錦草涼血化瘀止血，三味臣藥配伍可利水通淋，促進細菌內毒素排出。以苦參、白術為佐藥，苦參甘平，可健脾益氣，白術燥濕健脾。兩味佐藥有提高機體免疫力，促進機體恢復的功效。

作用機理：1）抗炎，復方總黃酮成分可通過抑制一氧化氮合酶，減少毛細血管內皮細胞釋放一氧化氮，調節花生四烯酸的代謝，抑制前列腺素E2 (PGE2) 和白三烯(LTC4) 的合成，其中以黃芩素和黃芩甙作用最強[15-16]。2）殺菌解毒，復方中的黃酮、蒽醌、有機酸等有效成分有強烈的抑菌作用，對消除細菌毒素對組織的損傷效果較佳[17-18]。黃芩有清熱解毒作用，通過降低腦脊液cAMP含量而拮抗內毒素致熱活性，黃芩的抗自由基作用是通過提高線粒體、溶酶體等內源性超氧化物歧化酶、琥珀酸脫氫酶等酶的活性而加速清除的，地錦草、黃酮也有清除和抑制羥基自由基的作用，黃芩地錦草還有止血、改善血管微循環，直接破壞內毒素的作用[19-20]。

3.2 復方中草藥對病魚肝臟功能的影響

魚類在感染細菌后，血液生化指標會發生相應改變，血清轉氨酶、甘油三酯、膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白、白球比等生化指標可反映肝臟的功能狀態，當肝臟受到病原等因素的損傷時血清轉氨酶會升高，其他指標會下降。本研究中，鯽魚患細菌性敗血?。?%藥餌組）4 d時，轉氨酶下降，甘油三酯、膽固醇、血清總蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白等其他肝功能指標下降，表明溫和氣單胞菌感染亦造成魚體肝功能改變。齊口裂腹魚（）感染嗜水氣單胞菌（）后，血清中谷草轉氨酶、總蛋白、球蛋白和甘油三酯含量與對照組均無差異顯著性，但總蛋白和球蛋白在攻毒后4 h時最低，之后有逐漸升高趨勢，而甘油三脂則隨著時間的延長有逐漸降低趨勢[21]，與本研究結果不盡一致。本研究血清轉氨酶下降的原因可能是由病魚嚴重的充血、出血、溶血所致；血清中甘油三酯、膽固醇、血清總蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白等下降說明病魚肝臟損傷、合成功能下降；血清總蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白和魚類免疫功能有關，說明鯽魚患細菌性敗血癥后免疫機能降低。與0%藥餌組相比，投喂藥餌組轉氨酶下降趨勢減緩，血清甘油三酯、膽固醇、總蛋白、白蛋白、球蛋白等與對照組的健康鯽魚測定值無顯著差異，說明中草藥復方藥餌改變了病魚轉氨酶的變化，促進了轉氨酶指標的恢復，說明藥餌改善了肝組織的炎癥損傷，使肝功能恢復到接近健康鯽魚（對照組）水平。

魚類細菌性敗血癥的病理模型可描述為：溫和氣單胞菌侵入魚體后，先在腸道內增殖，再經門動脈循環進入肝臟、腎臟及其他組織，引起肝臟、腎臟等器官以及血液病變，繼而出現全身癥狀[23]。本研究的復方中草藥有保護魚類肝功能，抗炎，改善微循環，并有抗凝血及抑制多種致病菌的作用，促進了患細菌性敗血癥鯽魚肝功能的恢復。

3.3 復方中草藥對病魚腎臟功能的影響

尿素氮、尿酸、肌酐是蛋白質代謝產物，血液中尿素氮、尿酸和肌酐的濃度間接地反映腎臟的排泄功能，腎功能下降時，血清尿素氮、尿酸、肌酐指標會升高[24]。米瑞芙[25]研究表明，鰱（）患敗血病后尿素、尿酸、肌酐顯著增加。龐啟華等[22]研究表明，人工感染豚鼠氣單胞菌 () CSS42菌株的豐產鯽尿酸濃度顯著升高，表明病魚腎功能出現障礙。本研究中感染4、15 d的病魚（0%藥餌組）血清尿素氮、尿酸、肌酐比對照組（健康魚）及其他藥餌組顯著上升，說明病魚腎功能受損；其他藥餌組與對照組差異無統計學意義，說明藥餌改善了病魚腎臟的受損狀態，使藥餌組病魚的腎功能恢復至正常水平。

3.4 復方中草藥對病魚造血功能的影響

間接膽紅素（IBIL）主要由紅細胞破壞而來，當體內紅細胞被大量破壞，產生大量的間接膽紅素，則超過肝臟代償能力，血中間接膽紅素含量升高，是造血功能和肝膽疾病的一個檢測指標[11]。鰱（）患敗血病后血清膽紅素顯著增加[25]。本研究中，與對照組（健康魚）相比，感染后的病魚（0%藥餌組）間接膽紅素顯著升高，這與病魚造血組織和肝臟的病變有關，當溫和氣單胞菌侵襲造血組織（器官），引起溶血，體內紅細胞大量破壞，產生大量的間接膽紅素，超過肝臟代償能力。各藥餌組病魚間接膽紅素與0%藥餌組相比較則下降，且與對照組健康魚無顯著性差異，這是因為，復方中的黃芩、地錦草成分有止血、改善血管微循環，減輕了細菌對造血組織（器官）的損傷。

3.5 復方中草藥對病魚心肌功能的影響

魚類多種細胞均含有肌酸磷酸激酶，但僅心肌和骨骼肌的肌酸磷酸激酶含量能改變血清中肌酸磷酸激酶的含量。當心肌細胞受損或通透性增高時，則將該酶釋放到血液中，骨骼肌嚴重出血，肌纖維的變性、壞死及明顯的病理改變也是血清肌酸磷酸激酶升高的原因?；加屑毦詳⊙Y的病魚未見骨骼肌出血現象，因此，罹患該病病魚肌酸磷酸激酶升高則由心肌功能受損所致。本研究中，感染溫和氣單胞菌的病魚肌酸磷酸激酶指標顯著上升，因此，病魚心肌功能受損，投喂藥餌的病魚與0%藥餌組比較，肌酸磷酸激酶指標下降，且與對照組健康魚血清肌酸磷酸激酶測定值無顯著性差異，表明藥餌改善了心肌的受損狀態。

由溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等細菌性感染的病魚，其血液生理生化指標數均有顯著改變，但具體指標究竟是增加還是減少，文獻報道不一致。鰱魚患敗血病后肌酸磷酸激酶顯著增加[25]，感染豚鼠氣單胞菌的豐產鯽肌酸激酶活性極顯著降低(< 0.01)，病魚心肌功能出現障礙[22]。史成銀等[26]認為，這可能與疾病的病程有關，并在Klontz等[27]研究中也有類似報道。本研究發現，健康鯽魚感染細菌性敗血癥后，病魚血液生化指標的變化與鰱魚患敗血病后血液生化指標變化[25 ]類似。但究竟是不是患細菌性敗血癥病魚血液生化指標變化的普遍現象，還有待更進一步研究。目前缺乏健康鯽及患病魚血液生理生化指標長期監測數據支撐，更需建立魚類細菌性敗血癥病理生理模型[28-32]，這是一項長期的任務。

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Prevention and Treatment Effect of Chinese Herbal Compound on Crucian Carp Bacterial Septicaemia

TIAN Hai-jun1, ZHENG Shu-ming2

(1.,464000,; 2.,,402460,)

To study the prevention and treatment effect of the Chinese herbal compound on bacterial septicemia of crucian carp,.Chinese herbal medicine mix from herba artemisiae, euphorbia humifusa atractylodes, radix et rhizoma rhei, radix scutellaria, ginseng, radix isatidis were prepared, and the total effective components of Chinese herbal medicine compound was prepared by soxhlet extraction method using ethanol as solvent. The extract was prepared by mass fraction 0%, 0.5% and 2.0%, and the raw material of the compound was prepared by mass fraction 2.0% (recorded as 0%, 0.5%, 2.0% of the bait group and 2.0% of the crude drug group, respectively). Crucian carp were artificially infected with, and infection was evaluated at day 4 and day 15. Serum biochemical parameter including transaminase (GPT, AST), triglyceride (TRIG), cholesterol (TC), total protein (TP), albumin (ALB), globulin(GLB), albumin to globulin ratio (A/G) liver function indicators, such as urea nitrogen (BUN), uric acid (UA), creatinine (CR), such as renal function indexes, myocardial function index of creatine phosphokinase (CPK) were analyzed.Under the conditions of 0.5×109cfu/mL and 1×109cfu/mLinfection, the control rates of baits in the 2% baits group were 82.5% and 42.5%, respectively. As compared with the 0% baits group, the efficacy was extremely significant (<0.01). Compared with the control group (healthy fish), the indexes of transaminase, TRIG, TC, TP, ALB, GLB, and A/G of the fish infected with 0.5×109cfu/mLdisease (0% diet group) were decreased (0.05), and the indexes of BUN, UA, CR, and CPK were increased (0.05), while the indexes of the other bait group were improved compared with the 0% bait group and recovered to the level of the control group.The compound could prevent and cure bacterial septicaemia of crucian carp, and improve the function of liver, kidney and myocardium. Compound extract of Chinese herbal medicine (2%) added with baits has significant efficacy in preventing and treating bacterial septicemia of crucian carp.

; bacterial septicaemia; blood biochemical indicators;Compound Chinese herbal medicine; therapeutic effect

S943.117.42+9

A

1673-9159（2020）02-0103-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.02.015

2019-08-09

河南省科技廳科技攻關項目（122102110146）“新型環境友好型漁藥的研制與安全性評價研究”

田海軍（1980－）男，碩士，副教授，研究方向為水生動物病理與病害。Email: thj_666@163.com

鄭曙明（1958—）女，教授。Email:zhsm22@126.com

田海軍，鄭曙明. 中藥復方對鯽魚細菌性敗血癥的防治效果[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（2）：103-110.

（責任編輯：劉慶穎）