常壓室溫等離子體誘變選育高產核黃素枯草芽孢桿菌

郭佳欣，張培基，劉丁玉，洪坤強，陳濤，王智文*

1(天津大學 化工學院，天津, 300350)2(系統生物工程教育部重點實驗室，天津, 300350)3(合成生物學前沿科學中心，天津, 300350)4(天津化學化工協同創新中心合成生物學平臺，天津, 300350)

核黃素是一種與生物生長緊密相關的物質，參與細胞的氧化還原和新陳代謝，與核酸、蛋白質以及脂肪的代謝有關，維護細胞功能的正常運行[1-2]。在醫藥與飼料領域有著廣泛的應用[3-7]。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP) 誘變技術作為一種近年來新興的高效誘變手段，具有突變譜廣、安全性高、操作快速簡單、成本低、環境友好等優點[8]。該方法在工業誘變育種中具有極大的應用潛力，ARTP誘變已經成功地應用于多種細菌和真菌，還應用在植物、藻類上，在促進細胞生長和細胞生物量的生產，提高酶活性，提高各種化學品產量等方面均有成功展示[9]。

誘變選育是提高核黃素產量的有效策略，但經過多輪突變和篩選后產量會達到瓶頸[10]。為了獲得更具有工業競爭力的核黃素高產菌，除了人工誘變外，代謝工程選育高產菌株也是重要的發展方向。最近，SHI等[11]通過過表達核黃素操縱子，解調嘌呤合成途徑轉錄水平和解除關鍵酶反饋抑制作用，改善嘌呤核苷酸的供應，得到了1株核黃素高產菌，產量較出發菌提升了3倍。BUEY等[12]通過過表達核苷酸生物合成的關鍵酶IMP脫氫酶，促進GTP的積累，使1株棉囊阿舒氏酵母菌的核黃素產量提升了40%。

本科研組前期通過隨機誘變、基因組重排和代謝工程等手段構建了一系列核黃素突變菌株，但是突變株存在生長緩慢、菌體濃度低、遺傳背景不清晰以及遺傳操作困難等問題。WANG等對B.subtilis24進行了全基因組測序和逆向代謝工程重構了1株遺傳背景清晰的重構菌枯草芽孢桿菌BS120，核黃素產量達到(1.85±0.03) g/L[13]。本研究進一步對BS120進行ARTP等離子誘變，篩選遺傳穩定的核黃素高產突變菌株，為探討核黃素高產的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株或質粒

核黃素生產菌BS120、核黃素操縱子質粒pMX45，保藏于天津大學代謝工程與系統生物學實驗室。

1.1.2 培養基

Spizizen基本培養基(g/L)：葡萄糖 8，(NH4)2SO40.2，KH2PO41.31，Na2HPO40.6，MgSO4·7H2O 0.2，檸檬酸三鈉二水 0.25，谷氨酰胺 2，色氨酸 0.05，VB1溶液 0.01，1 000×微量元素溶液 1 mL。

LB液體培養基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5和NaCl 10，pH 7.0。固體培養基加2%(質量分數)瓊脂。

96深孔板篩選培養基(g/L)：葡萄糖 40，酵母粉 8，尿素 2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO40.5，pH 7.0。

發酵培養基(g/L)：葡萄糖 100，酵母粉 20，尿素 2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO40.5，pH=7.0。

基本鹽培養基(g/L)：葡萄糖40，(NH4)2SO42，KH2PO413.1，Na2HPO46，檸檬酸三鈉二水1.2，MgSO4·7H2O 2.5，色氨酸0.05，1 000×微量元素500 μL。

1.1.3 主要試劑

酵母粉 YP601，安琪酵母股份有限公司；寡霉素、8-氮鳥嘌呤，大連美侖生物技術有限公司；D-(+)-葡萄糖，上海生工生物工程有限公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、紅霉素，BBI生命科學有限公司。

1.1.4 儀器與設備

ARTP-IIS誘變系統，北京思清源有限公司；TU-1901紫外分光光度計，北京譜析通用儀器公司；MULTIPLEX1R32R大型離心機，賽默飛世爾科技公司；SBA-40C生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；BIOMETRAPCR儀，Tpersonal。

1.2 實驗方法

1.2.1 ARTP誘變

挑取單菌落至基本鹽液體培養基中，37 ℃、220 r/min條件下培養至OD600為2.0～3.0，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗滌2次后，重懸菌體制成菌懸液備用。ARTP誘變條件為100 W、10 SLM、2 mm。吸取10 μL菌懸液均勻涂布至無菌載片上，誘變時間為20～60 s，誘變后的菌液加到4.99 mL PBS緩沖液的EP管中，振蕩混勻，取100 μL菌液涂布于Spizizen培養基固體平板，37 ℃恒溫培養至單菌落長出。繪制致死曲線，選擇出合適的誘變時間。

致死率計算如公式(1)所示[14]為：

(1)

1.2.2 篩選拮抗物最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的測定

將出發菌株的菌懸液經適度稀釋，取100 μL涂布在含有20～50 mg/L 8-氮鳥嘌呤或100～300 mg/L寡霉素的Spizizen基本鹽培養基平板上，37 ℃倒置培養48～72 h，以不含篩選拮抗物平板上菌體的生長狀況為對照，觀察并記錄未長出菌落的篩選拮抗物的最低濃度，即為該篩選拮抗物的MIC[15]，然后按MIC作為添加水平制作相應的篩選拮抗物篩選平板。

1.2.3 誘變菌株的初篩和復篩

取100 μL誘變后菌液涂布于含有相應篩選拮抗物MIC濃度的篩選平板，37 ℃恒溫培養12～16 h。挑取誘變的單菌落，對點到Spizizen基本鹽固體平板上，37 ℃，24～48 h。初篩后，挑取核黃素產量顯著提高的突變單菌落接種到5 mL液體LB試管中，37 ℃靜置過夜培養。取1 mL菌液接種至50 mL LB液體培養基的250 mL三角瓶中，220 r/min、37 ℃振蕩培養12 h，獲得一級種子。吸取適量的一級種子接種至100 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，初始OD為0.05，41 ℃、220 r/min振蕩培養96～120 h，測定核黃素的產量、殘糖，篩選出核黃素高產突變菌株。

1.2.4 發酵產物測定

1.2.4.1 核黃素濃度的測定

本實驗中核黃素濃度測定是通過紫外分光光度計測量OD444，有效范圍為0.3～0.8。使用0.5 mol/L NaOH溶液進行溶解稀釋，再用乙酸-乙酸鈉溶液稀釋并中和NaOH溶液，13000 r/min離心2 min沉淀固體雜質，測量上清液吸光度。

核黃素質量濃度核算[16]如公式(2)所示：

(2)

1.2.4.2 殘糖的測定

發酵過程中葡萄糖是利用生物傳感分析儀進行測定[16]。

1.2.5 核黃素操縱子質粒轉化

本實驗使用化學轉化法，即枯草芽孢桿菌的Spizizen轉化法[16]向枯草芽孢桿菌BSG3中轉化核黃素操縱子質粒pMX45。

1.2.6 遺傳穩定性分析

挑取單菌落至5 mL LB液體培養基，37 ℃培養12 h后，取100 μL菌液至另一支4.9 mL LB液體培養基試管，相同條件下重復轉接20次。根據公式計算代時得到一次轉接為6代，對第0、30、60、90、120代進行搖瓶發酵，測定核黃素濃度。

1.2.7 數據處理

實驗結果為3次獨立實驗的平均值，用平均值和標準偏差表示。采用單因素方差分析法進行統計學分析，用Origin 8.1軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 最佳ARTP誘變時間的選擇

在誘變處理時，對出發菌株BS120進行20、30、40、50、60 s誘變處理，并繪制致死率曲線(圖1-A)。當照射時間為30 s時，致死率達到45.02%; 照射時間為40 s時，致死率達到了91.30%。進一步測定35～40 s誘變后的致死率，對出發菌株BS120進行35、36、37、38、39 s誘變處理，并繪制致死率曲線(圖1-B)。誘變的致死率約為90%時，篩選到目標突變菌株的可能性最大[17]，所以選擇37s作為誘變時間。

A-誘變處理時間0、20、30、40、50、60 s；B-誘變處理時間35、36、37、38、39 s圖1 枯草芽孢桿菌致死曲線Fig.1 Lethal curve of Bacillus subtilis

2.2 誘變菌株的篩選與發酵驗證

2.2.1 8-氮鳥嘌呤為拮抗物的突變株篩選

8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine)作為核黃素合成途徑中核黃素前體物鳥三磷(guanosinetriposophate,GTP)的結構類似物可以阻斷磷酸核糖焦磷酸合成酶(pho-sphoribosyl-pyrophosphate synthetase,PRPS)對GTP的反饋抑制作用[18-19]，從而大量積累GTP進而有效促進核黃素的合成，增加核黃素的產量[20-21]。

為了測定8-氮鳥嘌呤對出發菌株BS120的MIC，將BS120菌懸液稀釋至菌體濃度為1×105個/mL涂布在添加了8-氮鳥嘌呤的Spizizen培養基中，37 ℃培養24 h，對平板上生長的菌落進行計數(表1)。

由表1可知， 8-氮鳥嘌呤的MIC為40 mg/L。將對BS120經ARTP誘變37 s后的菌液涂布于添加了40 mg/L 8-氮鳥嘌呤篩選平板，37 ℃，24～48 h，經過96孔板初篩后對產量較高的9株菌株進行搖瓶復篩(圖2)。其中編號為1-3-28的菌株搖瓶發酵96 h核黃素產量為(2 996.68±30.66) mg/L，得率為(30.52±1.18) mg/g葡萄糖，較BS120分別提高61.60%和58.12%，命名為BSG1。

表1 出發菌株BS120對8-氮鳥嘌呤敏感性Table 1 8-azaguanine resistance of BS120

注： “+++++”代表每板菌落數目超過104；“++++”代表菌落數目在103～104；“+++”代表菌落數目在102～103；“++”代表菌落數目在10～100；“+”代表菌落數目稀少，在10以內；“-”代表無菌落生長(下同)

圖2 8-氮鳥嘌呤為拮抗物的突變株搖瓶復篩結果Fig.2 Screening results of 8-azaguanine mutant strains

2.2.2 寡霉素篩選誘變菌株

寡霉素(oligomycin)作為細胞氧化磷酸化酶的抑制劑[22-23]。也可以促進呼吸鏈中黃素輔酶的需求量，進而促進核黃素的生物合成，提高胞內核黃素的含量[24]。為了測定寡霉素對出發菌株BSG1的MIC，將BSG1菌懸液稀釋至菌體濃度為1×105個/mL涂布在含寡霉素的Spizizen培養基中，37 ℃，24 h，對平板上生長的菌落進行計數(表2)。

表2 出發菌株BSG1對寡霉素敏感性Table 2 Oligomycin resistance of BSG1

由表2可知，寡霉素的MIC為300 mg/L，將誘變的菌株涂布于含有300 mg/L寡霉素篩選平板，經過96孔板初篩后選取產量較高的11株菌株進行搖瓶復篩(圖3)。其中編號為2-3-19的菌株搖瓶發酵96 h 核黃素產量為(3 403.76±55.96) mg/L，得率為(34.50±0.47) mg/g葡萄糖，較親株BSG1分別提升13.58%和11.54%，命名為BSG3。

圖3 寡霉素誘變菌株搖瓶復篩結果Fig.3 Screening results of oligomycin mutant strains

2.3 核黃素操縱子的過表達提高核黃素產量

核黃素操縱子過表達質粒pMX45是約28 kb的低拷貝數質粒，包含核黃素操縱子的EcoRI 酶切染色體片段(10 kb)和18 kb的載體兩部分組成[25]。將其轉入BSG3中以期為進一步提高核黃素產量，并同時對BSG5及BS120，BSG1，BSG3進行發酵驗證(圖4)。

圖4 BS120，BSG1，BSG3和BSG5發酵驗證Fig.4 Validation fermentationof BS120, BSG1, BSG3and BSG5

由圖4可知，BSG5在搖瓶發酵120 h核黃素產量可達到(4 467.08±99.47) mg/L，得率為(42.56±1.25) mg/g葡萄糖，較BSG3提升分別為31.24%和23.36%。質粒pMX45的導入促進核黃素產量得到了顯著提升。

2.4 突變菌株生長與核黃素合成能力

分別檢測了親本菌株和3株突變株的生長情況(圖5)。出發菌株BS120和BSG1，BSG3生長規律基本相同，而BSG5生長相對滯后。原因可能是導入的pMX45質粒較長，造成菌株生長代謝負擔加重，菌株生長變慢。

圖5 BS120，BSG1，BSG3和BSG5生長曲線圖Fig.5 Growth curve of BS120, BSG1, BSG3 and BSG5

隨后，對4株菌分別進行發酵表征，每隔12 h測定核黃素及殘糖(圖6)。

圖6 BS120， BSG1， BSG3和BSG5發酵表征對比圖Fig.6 Fermentation characterization of BS120, BSG1,BSG3 and BSG5

由圖6可知，在基本鹽培養基中，發酵到60 h時，4株菌株均基本停止耗糖。BSG5核黃素產量和得率達到(258.76±1.25) mg/L和(10.97±1.01) mg/g葡萄糖，較出發菌株BS120提升分別為92.73%和133.26%，優于BS120((134.26±2.69) mg/L和(4.69±0.19) mg/g葡萄糖)、BSG1((178.91±1.25) mg/L和(6.68±0.83) mg/g葡萄糖)及BSG3((194. 07±1.86) mg/L和(7.60±0.59) mg/g葡萄糖)。

2.5 突變菌株的遺傳穩定性

誘變菌株在不斷傳代的過程中可能出現退化現象，導致發酵性能下降，因此需要測試誘變菌株的遺傳穩定性。由圖7中知，BSG1、BSG3和BSG5產量基本穩定，具有良好的遺傳穩定性。

圖7 BS120，BSG1，BSG3和BSG5遺傳穩定性測試Fig.7 Genetic stability of BS120, BSG1, BSG3 and BSG5

3 結論與展望

本研究以BS120為出發菌株，依次使用8-氮鳥嘌呤和寡霉素作為篩選拮抗物，篩選到了核黃素產量顯著提高的突變株，說明ARTP誘變與合適的拮抗物篩選技術，是人工合成誘變獲得枯草芽孢桿菌高產突變株的有效手段。將來的工作可以圍繞兩方面進行展開：一方面，可以考慮選用其他與核黃素生產相關的結構類似物如玫瑰黃素、6-氯鳥嘌呤、別嘌呤[19]等作為篩選拮抗物進行誘變篩選，并結合具有更高篩選通量的的篩選技術，如流式細胞分選儀或者微流滴細胞分選儀[26]，以胞內核黃素熒光信號強度為分選標記，通過迭代誘變篩選，獲得生產性狀更加優越的誘變菌種；另一方面，可以通過對誘變菌株的基因組、轉錄組以及蛋白質組的分析，深入理解突變菌株高產核黃素的遺傳調控機理，通過逆向代謝工程構建高產核黃素菌株，獲得到產量較高且遺傳背景清晰的核黃素高產菌，為進一步闡釋枯草芽孢桿菌產核黃素遺傳基礎，探討核黃素高產的調控機制奠定基礎。