建立可量化的體外血小板、牙齦炎生物模型
——研究牙膏的功效作用

陳健芬 郭 慶 孫東方 吳文惠 蔡吳鳳 任 格

(1.蘇州市金茂日用化學品有限公司，江蘇 蘇州 215341；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.黑龍江省輕工科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150010；4.徐州工程學院，江蘇 徐州221018)

前言

血小板是一種具有膜結構的血液成分，在血液中發揮作用，主要是靠多種表面受體及存在于血小板中的可溶性介質來進行的。在正常的血液循環過程中，血小板處于穩定的靜止狀態,當血管壁出現損傷時，通過表面接觸和某些凝血因子的作用，血小板轉入激活狀態，出現凝集現象[1-3]。白芨提取物可通過增強血小板血栓素A2(TXA2)的活性進而增加血栓素B2(TXB2)含量，縮短凝血酶原時間，TXB2含量增多時，血小板凝聚活性越強[4]。白芨提取物還可通過抑制纖維蛋白酶活性從而降低血漿中環磷酸腺苷(cAMP)含量，使血細胞凝集形成人工血栓達到止血效果[5]。因而選擇檢測血小板聚集率、TXB2含量和cAMP含量3項指標，以評價添加白芨提取物或氨甲環酸的牙膏對牙齦出血的抑制效果。本研究建立可量化的血小板體外生物模型，探索口腔清潔護理產品及原材料對牙齦止血作用的有效性。

炎癥是機體組織對內外環境的有害刺激所產生的一種復雜的生理和病理反應。人牙齦上皮細胞(HGECs)為多角形，融合呈典型的“鋪路石”外觀。免疫細胞化學檢測顯示，該細胞角蛋白染色陽性，波形絲蛋白染色陰性，證實其為外胚層來源的細胞[6，7]。炎癥因子IL-1β具有調節免疫反應，誘導機體產生前列腺素E2、IL-2等炎癥介質[8]。炎癥因子IL-6可影響淋巴細胞的增殖分化，促進B淋巴細胞產生抗體，有利于機體抗感染，同時還可抑制成骨細胞膠原和非膠原蛋白的合成，作用于破骨細胞的前體而促進骨吸收[9]?？寡滓蜃覫L-10是一種能趨化中性多形核白細胞、T淋巴細胞和單核細胞等免疫細胞的細胞因子，能夠明顯抑制炎癥反應，在牙周炎的免疫反應中起中樞作用[10]。TNF-α是一種腫瘤壞死因子，主要由活化的巨噬細胞、NK細胞和T淋巴細胞產生，由于其缺少靶向性且有嚴重的副作用目前僅用于局部治療[11]。上述細胞因子分泌水平的變化，對于研究牙周組織的炎癥及免疫耐受性具有非常重要的意義。牙周病原菌內毒素(LPS)是一種由類脂A、核心寡聚糖和O-特異性多糖側鏈組成的糖脂類物質，是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分?？芍苯幼饔糜谘乐芙M織細胞，刺激單核細胞和巨噬細胞等效應細胞，誘發炎癥反應從而引起牙周組織的破壞[12，13]。同時，它也是一種潛在的細胞激活因子，對牙周炎的產生發揮著重要的作用。當前體外炎癥模型的細胞大多運用的是RAW264.7巨噬細胞[14]，而對人牙齦上皮細胞(HGECs)研究較少，本研究甄選了口腔中抵御病原微生物入侵的第一道屏障的HGECs為細胞模型，其更加貼切人體口腔粘膜組織結構，更具科學性、安全性及代表性 。

因牙齦炎是由茵斑微生物引起的牙周組織慢性感染疾病，其主要表現上皮和結締組織的破壞及牙槽骨的喪失[15]。1998年GeorgeHajishengallis等[16]人研究200g左右的大鼠口腔相當于人類成年45～65周歲的口腔環境，因此選用200g的雌性大鼠作為研究對象。常規的大鼠牙齦炎模型使用復合結扎的方式誘導牙齦炎大鼠模型，在結扎后需頻繁更換絲線，實驗步驟繁瑣，耗時耗力[17，18]。本實驗摸索出了在構建絲線結扎磨牙牙齦炎大鼠模型時，同時選用牙齦卟啉單胞菌(P.g)和具核梭桿菌(F.n)誘導[19]。以達到更快捷、更安全地建立大鼠牙齦炎模型的目的，通過檢測大鼠牙齦指數(GI)、菌斑指數(PI)和牙齦探診出血指數(BOP)，結合觀察X-ray形態指標，再進一步對唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)以及血漿中細胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量的檢測，從各方面佐證體外HGECs牙齦炎癥模型與大鼠體內牙齦炎模型檢測結果的一致性。

1 方法與結果

1.1 材料與分析

1.1.1 試劑與儀器

P.gingivalis(ATCC33277)，F.nucleatum(ATCC49256)，HGECs(上海賽齊生物技術公司)；Wistar大鼠、雌性新西蘭兔(SPF級，上海杰思捷實驗動物有限公司)；二磷酸腺苷(ADP，美國Sigma-Aldrich 公司，批號A2754)，水合氯醛(Chloralhydrate，10%，PH7.2)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；DMEM高糖培養基，0.25%胰酶，胎牛血清，青霉素和鏈霉素(美國Gibco 公司)；其他分析純試劑均采購于國藥、生工等國內試劑供應商。

1.1.2 主要試劑的配制

牙膏樣品前期處理：分別將白芨Ⅰ號牙膏、白芨Ⅱ號牙膏、陰性對照牙膏、添加氨甲環酸的牙膏四組樣品水浴浸提，浸提液過濾后離心取上清液后減壓旋蒸(40℃、75轉)至最初牙膏體積，置于真空干燥箱中干燥6h，再冷凍干燥得到牙膏的供試樣品，供試樣品及白芨提取物用0.9%的生理鹽水或DMEM培養基復溶(表1)，0.22μm的濾膜過濾,4℃保存備用(1周內用完)。

表1 實驗用體外血小板模型的牙膏樣品處理濃度

菌液的制備：P.g和 F.n接種于營養肉湯培養基中，在37℃厭氧條件下培養2～5d，挑取平板上單個菌落用無菌PBS(50mmol/L，pH=7.4)配制菌懸液5mL，并調節為0.5麥氏比濁濃度(1x108CFU/mL)，然后加入羧甲基纖維素，用0.22μm孔徑的濾膜過濾，配制成含2%羧甲基纖維素的新鮮菌液。

細胞培養：HGECs移至含有10%熱滅活牛血清DMEM高糖培養基中，添加1%100μg/mL的青霉素和鏈霉素，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱內培養。及時換液并傳代培養，取5～6代生長狀態呈對數期的細胞進行試驗。

表2 主要儀器

1.1.3 統計學分析

應用SPSS17.0軟件包分析處理實驗數據，采用單因素方差分析和LSD檢驗比較組間的差異。所有組的數據使用K-S檢驗正態性，發現數據為正態性分布，使用單因素方差分析對各組相應指標的均數進行顯著性檢驗，并通過LSD檢驗進行樣本均數的兩兩比較，以雙側P<0.05為差異有統計學意義。

1.2 建立基于血小板生理變化的體外實驗模型

1.2.1 試驗方法

采用心臟采血法13收集新西蘭雌性大白兔新鮮血液，離心后將血小板密度調整為1×1012/L，按照設計的實驗方案檢測空白時的吸光度OD0，按照試驗的分組情況加入不同的牙膏樣品(5ul/well)，輕微震蕩。再將該96孔板置于37℃下恒溫孵育5分鐘，充分反應。隨后加入5ul的ADP溶液輕微震蕩以誘導血小板聚集，血小板出現聚集反應后，相應體系內的濁度會發生變化。根據酶標儀中的OD值的變化計算血小板聚集率，其計算公式如下。按照ELISA試劑盒說明書檢測兔血漿中的cAMP、TXB2含量。

1.2.2 體外兔血小板生物模型中血小板聚集率、TXB2、cAMP含量的結果

采用兔血漿并通過ADP誘導血小板活化，檢測樣品處理組孵育血小板后的血小板聚集率、血小板生理代謝的主要產物TXB2及生命信息傳遞信使cAMP，每組重復5次，結果如圖1。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

血小板聚集率是反映血小板凝聚功能的重要指標，是止血功能的最早反應，血小板聚集率增高時則呈現血栓狀態[20]。樣品A、B、C、D、E處理后稀釋為0.05%～0.80%，檢測其對ADP誘導的血小板聚集率的影響，其中濃度為0.10%～0.40%的各牙膏樣品效果較顯著。結果表明：0.20%左右的白芨提取物(E)的血小板聚集率最高，比陰性對照牙膏(C)高出為32.27%±3.07%(P<0.05)。其次是稀釋為0.10%的氨甲環酸牙膏(D)，血小板聚集率比陰性對照牙膏高28.96%±2.66%(P<0.05)，白芨Ⅰ號牙膏和白芨Ⅱ號牙膏的血小板聚集率也均有顯著性增高(P<0.01)，說明添加有白芨提取物或氨甲環酸的牙膏均有明顯的止血效果。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

TXB2是血小板花生四烯酸代謝途徑環氧化酶的主要產物之一，白芨提取物及其牙膏和氨甲環酸牙膏可促進血小板環氧化酶[21]，因此檢測白芨提取物及其添加白芨提取物或氨甲環酸牙膏刺激血小板體外模型后血小板分泌TXB2的含量來推斷血小板的活性，TXB2含量越高，表示血小板生理活性越活躍。結果表明：稀釋為0.40%左右的白芨提取物的效果最為顯著，TXB2含量比正常血漿高7.11ng/L±0.22ng/L(P<0.001)；其次氨甲環酸牙膏、白芨Ⅰ號牙膏和白芨Ⅱ號牙膏也能顯著性增加血漿中TXB2含量(P<0.01)。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

在血小板中，cAMP可通過蛋白激酶A有效地刺激膜上的一種蛋白磷酸化，并通過對鈣攝入的影響，調節血小板收縮的生理功能[22]，而白芨提取物及其牙膏可抑制蛋白激酶的活化從而影響cAMP分泌，cAMP含量越高表示血小板越呈老化狀態[23]。結果表明：0.40%左右的氨甲環酸牙膏組的效果最為顯著，cAMP含量比正常血漿低292.53nmol/L±2.32nmol/L(P<0.01)，而白芨提取物、白芨Ⅰ號牙膏與白芨Ⅱ號牙膏組也能顯著性減少cAMP含量(P<0.05)。

1.3 體外HGECs牙齦炎模型的細胞因子IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α變化

1.3.1 細胞活性檢測

CCK-8試劑可用于檢測牙膏樣品對HGECs細胞增殖和毒性分析，根據加藥后細胞存活率以篩選HGECs的最適牙膏樣品濃度值[24]。加入濃度梯度的牙膏樣品處理(含10μg/mLLPS)，充分孵育后加入CCK-8試劑，用酶標儀測量550nm處各孔的吸光值，細胞存活率在80%-100%的牙膏樣品濃度為對HGECs最安全也是最適宜的處理濃度。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環酸牙膏；樣品E：白芨提取物。

CCK-8試劑用于添加白芨提取物或氨甲環酸牙膏最適濃度的篩選，具有靈明度高、細胞毒性小、結果優于MTT等多種優點[25]。結果顯示：采用0.5ug/ml樣品濃度評價各組牙膏樣品的抗炎作用最適(P<0.05)。

1.3.2 HGECs牙齦炎模型中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的檢測結果

采用酶聯免疫吸附法20檢測經LPS誘導，牙膏樣品孵育后的HGECs所分泌細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量，依IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α的ELISA試劑盒說明書檢測。每個實驗重復5次，結果如下圖。

樣品A：白芨Ⅰ號牙膏；樣品B：白芨Ⅱ號牙膏；樣品C：陰性對照牙膏；樣品D：氨甲環酸牙膏；樣品E：白芨提取物。P<0.05用*表示；P<0.01用**表示；P<0.001用***表示。

IL-10為抗炎因子，可通過釋放免疫介質從而達到抑制炎癥作用；IL-1β、IL-6為炎癥因子，當機體發生炎癥時這兩種細胞因子相應增加[18]；TNF-α是一種腫瘤壞死因子，可通過引起一些炎癥反應使腫瘤細胞出血性壞死。Control為經LPS誘導后的HGECs炎癥模型。結果表明：經氨甲環酸牙膏組處理HGECs分泌的IL-10含量最高，為98.95ng/L±2.42ng/L(P<0.001)；IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子TNF-α含量最低，分別為6.12ng/L±0.02ng/L，6.36ng/L±0.04ng/L(P<0.01)，13.09ng/L±0.01ng/L(P<0.01)；其中白芨提取物、白芨Ⅰ號牙膏和白芨Ⅱ號牙膏對HGECs炎癥模型分泌的細胞因子也均表現有顯著性差異(P<0.05)。

1.4 建立大鼠牙齦炎模型——驗證HGECs體外牙齦炎模型的有效特性

1.4.1 試驗方法

SPF級Wistar大鼠共20只，雌性，體重200±20g，活動良好，無齲壞，無牙周病。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5mg/kg麻醉后，選擇雙側上頜第二磨牙用5-0醫用絲線結扎于牙頸部，結扎絲線盡量放入齦溝內，遇結扎線脫落需重新結扎(圖6)。結扎后用10%糖水代替飲水喂養，每隔一天接種一次制備好的菌液0.5ml。建模成功后給試樣15d，檢測大鼠唾液的免疫球蛋白igG、igM、igA因子(表3)，GI、PI、BOP結果(圖7)，大鼠血漿中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6因子(圖8)和X-ray形態學分析(圖9)。

圖6 大鼠牙齦炎第二磨牙的絲線結扎

1.4.2 試驗結果

用酶聯免疫吸附法22檢測第三、六周大鼠口腔中唾液分泌的免疫球蛋白IgG、IgM及IgA，采用探針檢測各組大鼠口腔的牙齦指數，用酶聯免疫吸附法檢測用藥15d的大鼠血漿中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的含量，每組重復3次，結果如表3。

表3 各組大鼠唾液的IgG、IgM、IgA比較

IgA為分泌性的免疫球蛋白A，是機體抵御病原體的第一道免疫防線，有效地阻止口腔中有害物質進入上皮細胞[26]；IgM為免疫球蛋白M，是免疫應答中最早出現的抗體，可根據其含量來評價口腔中牙齦炎的修復作用[27]；IgG是免疫球蛋白G，是血清中主要的抗體成分，唾液中含量極低。對照組(F)為患嚴重牙齦炎的大鼠模型，空白組(G)為牙齦健康的大鼠。結果表明：氨甲環酸牙膏處理后IgA的變化最為明顯，增加了1.18mg/L(P<0.01)；白芨Ⅰ號牙膏處理后IgM增加了410ng/L(P<0.01)；而IgG在第三周大鼠口腔發炎嚴重時,由于牙齦易出血導致能在口腔唾液中到大量血清中的IgG，但第六周牙膏處理后則恢復正常值。

A：白芨Ⅰ號牙膏組；B：白芨Ⅱ號牙膏組；C：陰性對照牙膏組；D：氨甲環酸牙膏組；E：白芨提取物組；F：對照組；*P<0.01；**P<0.01；***P<0.001

牙齦指數GI通過檢查牙齦顏色和質的改變評價口腔的健康情況，菌斑指數PI根據牙面菌斑的厚度評價口腔中牙周病防治效果，牙齦出血指數BOP則是通過探針刺激牙齦部分評價口腔牙齦的病理狀況[28,29]。對照組(F)為患牙齦炎的大鼠模型。結果表明：大鼠牙齦炎模型中，白芨提取物處理的大鼠口腔GI、PI、BOP均顯著性減少(P<0.001)，其次是白芨牙膏和氨甲環酸牙膏處理組(P<0.01)，表明白芨提取物和添加有白芨提取物或氨甲環酸的牙膏對口腔牙齦炎均有顯著的治愈作用。

A：白芨Ⅰ號牙膏組；B：白芨Ⅱ號牙膏組；C：陰性對照牙膏組；D：氨甲環酸牙膏組；E：白芨提取物組；F：對照組；G：空白組。(#P<0.05；##P<0.01；###P<0.001vs.Fgroups；* P<0.01；** P<0.01；***P<0.001vs.Ggroups)

對照組(F)為患嚴重牙齦炎的大鼠模型，空白組(G)為牙齦健康的大鼠。結果表明：白芨提取物處理組的血漿中IL-10含量最高，為27.98ng/L±1.22ng/L(P<0.05)；IL-1β、IL-6、TNF-α含量最低，分別為12.26ng/L±0.30ng/L(P<0.001)，2.62ng/L±0.01ng/L(P<0.001)，103.99ng/L±4.37ng/L(P<0.001)；添加白芨提取物或氨甲環酸牙膏組對大鼠牙齦炎模型也均有顯著性修復效果(P<0.05)。

給試樣15d后，大鼠上頜牙周組織的X射線顯示牙槽骨影像如圖9。

對照組(F)為患有嚴重牙齦炎的大鼠口腔上顎，由對照組中星號處可觀察到明顯的銀乳頭退縮和炎性細胞浸澗，銀乳頭位于釉牙骨質界下方，牙槽帷高度降低，牙槽崎頂到釉牙骨質界的距離顯著増加。圖9中A、B、D、E是各組牙膏修復后的大鼠牙銀組織，與對照相比，各實驗組牙膏處理牙齒排列緊密，牙齒與牙槽貼合緊密，從給試樣組星號處可觀察到大鼠第二磨牙與相鄰磨牙間隙明顯減小。而陰性對照牙膏處理組(C)處理的第二磨牙與相鄰磨牙間隙與空白組相比變化不明顯。結果表明：白芨提取物和添加白芨提取物或氨甲環酸的牙膏可明顯改善牙周炎大鼠牙間隙以及牙齒與牙槽縫隙。

A：白芨Ⅰ號牙膏處理組；B：白芨Ⅱ號牙膏處理組；C：陰性對照牙膏組；D：氨甲環酸牙膏處理組；E：白芨提取物處理組；F：對照組☆：牙槽骨吸收；★：牙槽骨修復

2 討論與結論

2.1 長期以來針對口腔清潔護理產品的此類抗牙齦炎及牙齦出血等功效的的臨床評價，存在著成本高、耗時長，對受試者控制難，操作繁瑣，且臨床測試結果達不到預期等局限性，同時還存在一定的盲目性。因此建立體外血小板、牙齦炎的生物模型，作為未來口腔清潔護理產品及其材料功效作用的研究與評價，具有充分必要性。

2.2 血小板活化是一個自我放大的級聯反應。ADP誘導的血小板聚集及凝血因子的檢測廣泛用于止血藥物的評價，其中cAMP和TXB2在該條止血途徑發揮主要作用[30]。白芨Ⅰ號牙膏、白芨Ⅱ號牙膏、陰性對照牙膏、氨甲環酸牙膏和白芨提取物稀釋為40%時差異極顯著(P<0.05)，其血小板聚集率分別是61.64%、61.26%、57.59%、65.56%、75.23%；cAMP含量分別為330.61nmol/L、416.56nmol/L、449.78nmol/L、244.60nmol/L、313.41nmol/L；TXB2含量分別為6.22ng/L、5.88ng/L、5.43ng/L、10.04ng/L、11.36ng/L。研究結果表明在體外血小板生物模型中，體外止血效果依次為：白芨提取物>氨甲環酸牙膏組>白芨Ⅰ號組>白芨Ⅱ號牙膏組>陰性對照牙膏組。同期采用的動物體內實驗,以X-ray組織觀察、探針出血指數(BOP)、唾液中免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)等含量為評價指標，結果顯示牙膏樣品在動物體內與體外的血小板生物模型上的止血效果呈正相關性。因此，本研究建立的以血小板生物模型作為未來代替動物體內實驗，探索出了新的研究思路與方向，并且驗證了未來可運用血小板生物模型作為代替動物體內的牙齦止血實驗的可行性。

2.3 通常LPS耐受的研究主要集中于單核/巨噬細胞等免疫細胞。還尚缺乏HGECs免疫耐受的直接報道，Muthukuru的研究已證實，慢性牙周炎患者的牙齦組織中，HGECs能夠識別LPS等毒力因子[31,32]，因此研究選擇最貼近最外層易感染的HGECs作為研究對象。CCK-8檢測顯示選擇0.5ug/mL的樣品濃度檢測炎癥因子，白芨Ⅰ號牙膏、白芨Ⅱ號牙膏、陰性對照牙膏、氨甲環酸牙膏和白芨提取物對LPS刺激HEGCs細胞上清液中IL-10含量均呈極顯著性增加(P<0.001)，IL-6顯著性減少(P<0.01)，TNF-α一般性減少(P<0.05)，IL-1β無明顯差異。通過比對大鼠血漿中細胞因子IL-10、IL-6、IL-1β、TNF-α含量及牙齦炎模型探針牙齦診斷(GI、PI)，為驗證上述實驗樣品牙膏對牙齦炎的抑制作用取得了重大突破。研究表明牙膏在動物體內炎癥介質和細胞因子的抑制作用與體外HGECs牙齦炎模型的檢測結果具有一致性，為未來逐漸淘汰動物體內炎癥模型提供了可靠的方法依據。

2.4 目前，我國在針對口腔清潔護理產品(含氟防齲再礦化、除漬美白除外)的體外功效評價模型的建立上，尚缺乏快速、便捷、可靠的方法或手段。研究結果表明，建立體外血小板、牙齦炎的生物模型，通過對酶分子水平和細胞因子表達的考察，并與體內大鼠牙齦炎模型作結果一致性的驗證。實現了在較短時間內評價口腔清潔護理用的材料及其產品的功效。從而提升了原材料及其產品功效研究的時效性，大大降低了資金投入成本，更是提供了快捷、高效、可靠且更具安全、科學性的評價手段。同時也為口腔清潔護理用品行業對相關產品的功效驗證提出了一種新的思路與途徑。此外，通過本研究摸索，為日后進一步深入探究功效材料及其產品對口腔細胞在核酸、蛋白及分子水平方面的作用機制做了鋪墊。